Диссертация (1144823), страница 51
Текст из файла (страница 51)
В первом путизадействованы факторы регуляции транскрипции LTS3 и SUP-I. В случае егоблокирования, возможно переключение на альтернативный путь, в нормерепрессированный продуктом гена SUP3.287ВрезультатеУФ-мутагенезаоранжевогосветочувствительногомутанта генотипа chl1 по гену CHLH, и дальнейшего многоступенчатогоотбора темно-коричневых клонов получен двойной мутант с нарушеннойрегуляцией биосинтеза ХЛ, накапливающий в 20 раз более ПП, чемисходный мутант. Хлоропластная мутация mod-u-25, усиливает (вдвое)накопление АЛК у двойных мутантов генотипа: chl1, mod-u-25,не снижаетчувствительность АЛК-синтезирующих ферментов к угнетению гемом, и невлияет на процесс синтеза протогема в клетках хламидомонады.
Мутациятестируется по устойчивости к 10 mМ левулиновой кислоты. Эффектмутации состоит в отсутствии темновой репрессии транскрипции генов:CHLH, GTR и CABII, кодирующих белки МХ, АЛК-синтезирующегокомплекса и светособирающего комплекса фотосистемы II, соответственно.Сохранение высокого уровня транскрипции гена CABII в условияхдеструкции хлоропласта характерно для GUN-мутантов арабидопсиса, укоторых нарушена система передачи регуляторных сигналов из хлоропластав ядро.
Gun-фенотип (отсутствие темновой репрессии гена CABII)демонстрировали мутанты по гену CHLH большой субъединицы МХгенотипа: brs-1, и chl1,mod-u-25, но не chl1, что позволяет отнести продуктгена Mod-u-25 хламидомонады к факторам, задействованным в путипередачи сигнала из хлоропласта в ядро. В отличие от уже известных GUNбелков, фактор Mod-u-25 кодируется хлоропластным геномом.В целом, проведенные исследования свидетельствуют, что темновыереакции биосинтеа ХЛ у хламидомонады регулируются на уровне первогофермента этого пути - МХ, и еѐ функционирование в большей степениопределяется большой (CHLH) субъединицей этого комплекса. В работевпервые был клонирован и исследован ген CHLH большой субъединицы МХхламидомонады.
Также, нам удалось обнаружить несколько, до сих порнеизвестныхгенов,продуктыкоторыхзадействованыврегуляцииактивности МХ. Ядерный ген LTS3 кодирует фактор транскрипции, который288активирует эспрессию генов ферментов биосинтеза ХЛ: МХ и АЛКсинтезирующего комплекса (белок GSA-AT) в темноте. Это первый фактортранскрипции, описанный у хламидомонады, который задействован врегуляциигенов,контролирующихтемновыепроцессыхлорофиллобразования. Изучение супрессии мутаций в гене LTS3 позволилонайти два ядерных гена: SUP-I и SUP3. Продукт SUP-I, вместе с LTS3задействованвтранскрипционнойрегуляциитемновыхпроцессовбиосинтеза ХЛ.
Ген SUP3 контролирует альтернативный LTS3-путимеханизм их регуляции.В случае мутационного блокирования магний-хелатазы, усилениеактивностиАЛК-синтезирующихферментовведеткизбыточномунакоплению его субстрата – ПП. В работе удалось обнаружить новыймеханизм,препятствующийнакоплениюэтогосильногофотосенсибилизатора, губительного для клетки в условиях освещения. Онконтролируется хлоропластным геном, названным Mod-u-25. Это первый,обнаруженныйухламидомонады,регулирующийактивностьхлоропластныйАЛК-синтезирующегодетерминант,ферментативногокомплекса.
Gun-фенотип мутации mod-u-25 позоляет предполагать, чтопродукт этого гена задействован в ретроградной регуляции, – контролехлоропластом экспрессии ядерных генов белков фотосинтеза. Молекулярнаяприрода гена Mod-u-25 и его продукта пока остается неизвестной.Становиться все более очевидно, что в регуляции светонезависимогобиосинтезахлорофилловмагний-хелатазаиграетключевуюроль.Исследования, редставленные в работе, позволили установить, что, помимогена GUN4, кодирующего позитивный регулятор активности фермента напосттрансляционном уровне [Formighieri et al., 2012], у хламидомонадыфункционированиеМХнатранскрипционномуровнеконтролируютпродукты ядерных генов LTS3 и SUP-1 и хлоропластный детерминант Mod-u25 (рисунок 6).289АБРисунок 6А. Посттрансляционная регуляций синтеза ХЛ в растительнойклетке.
Синтез АЛК репрессируют (стрелки): протохлорофиллид, связываясь сбелком FLU, и гем, взаимодействуя с ферментом Glu-TR. Белок Gun4 связываетмагний-хелатазу (МХ) с мембранами хлоропласта, активируя еѐ активность.6Б. Новые факторы регуляции Мg-хелатазы (МХ), обнаруженные в работе.Темновой биосинтез ХЛ обеспечивается путем транскрипционной активациигенов, кодирующих МХ и АЛК-комплекс. Фактор LTS3 активирует транскрипциюгенов МХ и GSA-AT; фактор SUP-3 репрессирует МХ; фактор SUP-I – активатортранскрипции LTS3; Mod-u-25 – репрессор синтеза АЛК и МХ. Гены,обнаруженные в работе, – в розовых прямоугольниках.Результаты представленных исследований позволяют говорить осуществовании в системе регуляции биосинтеза ХЛ у хламидомонадымеханизмов, координирующих работу двух основных ферментативныхкомплексов – МХ и синтеза АЛК.
В отличие от хорошо известногомеханизмаобратногоингибирования«feedback»синтезаАЛКпротохлорофиллидом и гемом, действующими на посттрансляционномуровне, регуляторный контур магний-хелатаза (МХ) – АЛК, по-видимому,290представляет собой систему «feedforvard», когда усиление актиности МХведет к активации АЛК–синтезирующего комплекса. На посттрансляционномуровне модулятором этого контура может служить белок GUN4, атранскрипционнаяактивациягеновобоихферментныхкомплексовосуществляется продуктами генов LTS3 и SUP-I, описанных в работе.Обнаружение новых генов, контролирующих регуляцию процессовхлорофиллобразования у зеленой водоросли C.
reinhardtii поставило новыевопросы, ответы на которые еще предстоит отыскать. Регулирует ли фактортранскрипции LTS3 только гены ферментов биосинтеза хлорофилла, или онконтролирует и процессы азотного и углеродного метаболизмов вфотосинтезирующейклетке?Какфункционируеттранскрипционныйкомплекс, в составе которого работают продукты генов LTS3 и SUP-I? Каковагенетическаяприродахлоропластногогена,кодирующегофакторретроградной регуляции Mod-u-25? Ответы на эти, и многие другие вопросыприблизят нас к пониманию механизмов, которые позволяют хлорофиллсодержащей клетке, живущей в гетеротрофных условиях, адаптироваться ксвету, и как эти механизмы формировались в процессе эволюции.Фундаментальные исследования, представленные в настоящей работе,имеютнесомненнуюпрактическуюзначимость.Изучениемутантовхламидомонады, дефектных по гену CHLH с нарушенной регуляцией,привелокполучениюштаммов-продуцентовхимически-чистогопротопорфирина IX (ПП).
ПП – природный циклическийтетрапиррол,общий биосинтетический предшественник гема и хлорофилла, являетсясильным природным фотосенсибилизатором иУникальныефотохимическиесвойстваэтогоиндуктором апоптоза.соединениясостоятвспособности его молекул адсорбировать световую энергию. При поглощениифотона молекула переходит в кратковременное возбужденное состояние, изкоторого может вернуться в основное синглетное состояние, отдав энергию ввиде флуоресценции, либо перейти в возбужденное триплетное состояние.291Взаимодействие с кислородом приводит к появлению активных формкислорода (АФК), которые и запускают процессы разрушения липидовклеточных мембран. Пигмент флуоресцирует в красной области спектра(λ=606 нм и 604 нм при возбуждении светом с длиной волны 405 нм) испособен накапливаться в пролиферирующих тканях, что позволяетиспользовать его в целях флуоресцентной диагностики канцерогенеза.Являясь сильным фотосенсибилизатором (веществом, способным приосвещении генерировать АФК), накопленный в тканях ПП при освещениивызывает быструю деструкцию окружающих тканей и применяется вфотодинамической терапии (ФДТ).
Еще одна, совсем новаяобластьприменения ПП, связана с нанотехнологиями - созданием порфиринсодержащих полимеров - основных компонентов сенсоров, позволяющихвыявлять широкий спектр токсичных элементов в окружающей среде [Asanoet al., 2010]. Технологические перспективы будущего связаны с созданиемсинтетических энергопреобразующих структур на основе порфиринов. Вэтих трехкомпонентных системах (безметалльный порфирин — Zn порфирин— хинон) осуществлена последовательность событий, реализуемых вфотосинтезирующих организмах: поглощение света → миграция энергии →разделение зарядов. Такие синтетические структуры могут стать прообразомискусственных энергопреобразующих устройств будущего. Таким образом,перспективы применения ПП (как в фундаментальном, так и в прикладномаспекте) связаны с возможностью создания гибридных наноразмерныхбиоэнергетических и биосенсорных устройств.
Результаты работы могутбыть использованы при подготовке материалов по новым курсам лекций«Генетика фотосинтеза» и «Генетика микроводорослей», на кафедрегенетики и биотехнологии СПбГУ, и аналогичных курсов в другихуниверситетах России.292ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ1. Идентифицировано два ядерных гена Chlamydomonas(С) reinhardtii:CHLH и LTS3, рецессивные мутации в которых блокируют биосинтезхлорофилла (ХЛ), приводя к накоплению его интермедиата протопорфиринаIX (ПП) в темноте.
Мутанты по гену CHLH светочувствительны, а LTS3мутанты способны зеленеть на свету.2. Клонирован и секвенирован ядерный ген CHLH C. reinhardtii,кодирующий большую H субъединицу магний-хелатазы (МХ) – первогоспецифического фермента биосинтезаХЛ. Охарактеризованы егоструктура и функции, идентифицированы мутантные аллели.3. Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3 C. reinhardtii,Он кодирует фактор транскрипции семейства GATA, который активируетэкспрессию генов ферментов биосинтеза ХЛ - МХ и АЛК-синтезирующегокомплекса в гетеротрофных условиях.4.Результатомисследованияобнаружение двух новых ядерных геновсупрессииlts3-мутацийсталоSUP-3 и SUP-I C.
reinhardtii,кодирующих факторы регуляции активности МХ. Продукт SUP-I, вместе сLTS3 задействован в транскрипционной активации темновых процессовбиосинтеза ХЛ и необходим для зеленения. Ген SUP3 контролируетальтернативный LTS3-пути механизм регуляции.5. Описана новая хлоропластная мутация mod-u-25, которая приводитк сверхпродукции по ПП в клетках двойных мутантов C. reinhardtiiгенотипа: chl1, mod-u-25 за счет усиленияяя синтеза АЛК.
Эффект мутациисостоит в отсутствии темновой репрессии транскрипции генов: CHLH,GTR и CABII, кодирующих белки МХ-хелатазы, АЛК-синтезирующегокомплекса и светособирающего комплекса ФСII. Продукт гена Mod-u-25является первым из хлоропластных детерминант, задействованным врегуляции пути передачи сигнала из хлоропласта в ядро.293ЛИТЕРАТУРА1. Александрова Н.Н., Крэла Л.П., Тугаринов В.В. Генетическая детерминацияпризнаков хлоропласта у хламидомонады. Сообщ. I. Создание множественномаркированных линий // Исследования по генетике. − 1979. − Вып. 8. − С.
139 149.2. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Фрадкин Л.И. Определение Mg-протопорфиринIX монометилового эфира в листьях ячменя и пшеницы // Вести БелорусскойАН. Сер. Биологические науки. − 1980. − N 6. − С. 25-29.3. Беляева О.Б., Литвин Ф.Ф. Фотоактивные пигмент-ферментные комплексыпредшественника хлорофилла в листьях растений // Успехи биологическойхимии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
