Диссертация (1144823), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Установлено, что транскрипция HSP70A вклетках дикого типа хламидомонады, выращенных в темноте, активируется270магний-протопорфирином IX и гемом также, как и в случае их переноса насвет [Kropat et al., 1997; von Gromoff, 2008]. Изучение влияния света наэкспрессию этого гена (рисунок 3.43) в клетках мутантов по гену CHLHпоказало, что у двойного мутанта генотипа: chl1,mod-u-25 в отличие отодиночного (chl1) и штамма дикого типа в темноте уровень транскриптовгена HSP70A сходен с таковым при световой индукции.
Такая же картинанаблюдается и в клетках мутанта brs-1.Рис. 3.43.Экспрессия гена HSP70A у штаммов C. reinhardtii указанныхгенотипов. Нозерн блот гибридизация проведена с пробой, специфичнойдля гена HSP70A, описанной как HSP70-2 (von Gromoff, et al., 1989)Подобная закономерность (отсутствие темновой репрессии) характерна идля транскриптов гена CABII (в современной номенклатуре - LHCBP1 –GeneID:5725483),кодирующегохлорфилла/b-связывающиебелки,ассоциированные с фотосистемой 2 [Savard et al., 1996].
Введениеэкзогенного магний-протопорфирина IX в условиях темнового роста неоказывает видимого влияния на экспрессию гена CAB2 (рисунок. 3.44)Таким образом, изучение влияния мутации mod-u-25 на транскрипциюгенов: HSP70A и CABII показало, что в отличие от штаммов дикого типа имутанта chl1, экспрессия этих генов у двойного мутанта ch11,mod-u-25,271.Рис.
3.44. Влияние магний-протопорфирина IX (Mg) и света на экспрессиюгена CABII. Аликвоты РНК (20 мкг) из клеток штамма дикого типа (wt) имутантов, растущих в темноте (Т), после добавления экзогенного Mg-ПП (8µМ) в течение 1 часа (Mg), и после переноса их на свет. Нозерн-блотгибридизацию проводили с пробой PHS16, специфичной для РНК гена CabII.также как и у мутанта brs-1 не подавлена в темноте, то есть они имеют gunфенотип.
Поскольку gun-фенотип характеризует нарушения в системепередачи сигналов из хлоропласта в ядро, предположили, что фактор,кодируемый хлоропластным геном Mod-u-25, по-видимому, задействован врегуляции транскрипции анализируемых генов, - в условиях деструкциихлоропласта, он участвует в подавлении экспрессии генов биосинтеза ХЛ иHSP70A.Тот факт, что клетки двойных мутантов генотипа ch1l,mod-u-25 втемноте демонстрируют сверхпродукцию АЛК и ПП, послужили поводомпроверить в них уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты синтезаэтих интермедиатов биосинтеза ХЛ: GTR (глутамил-тРНК-редуктазы) иCHLH–больщой субъединицы МХ (рисунок 3.45). У штамма дикого типа(wt) экспрессия обоих генов активируется светом, а экзогенный Mg-ППусиливает в темноте транскрипцию гена GTR, но не CHLH.
Уровеньсодержания транскриптов этих генов в клетках двойного мутанта (chl1,modu-25) в условиях темнового роста оказался не ниже такового в условияхосвещения.272Рис. 3.45. Экспрессия генов: CHLH и GTR в клетках дикого типа (wt) идвойного мутанта (chl1,mod-u-25). Нозерн блот гибридизация проведена спробами, специфичными для РНК указанных генов. CBLP - контрольПодобные результаты можно трактовать либо как отсутствие световойиндукции анализируемых генов (как часто трактуется в литературе), или какотсутствие репрессии (в норме) транскрипции этих генов в темноте.
Второйвариант, нам представляется, более точно отражает наблюдаемую картину.Влияние изучаемой аллели хлоропластного гена mod-u-25 на экспрессиюанализируемых генов состоит, по-видимому, в блокировании механизмарегуляции,направленногопротопорфириноввнаснижениефотосинтезирующихнакопленияклеткахфототоксичныхпутемрепрессиитранскрипции генов, ферментов синтеза ХЛ.3.5.6.
Обсуждение результатовЦентральную роль в регуляции биосинтеза ХЛ играют механизмыконтроля функциональной активность ферментов, синтезирующих АЛК.Анализ пигментных мутантов фотосинтезирующих организмов позволилвыяснить,чтоэтарегуляцияосуществляетсяпорфириновымиинтермедиатами (протохлорофиллидом и гемом) путем ретроингибированияи репрессии синтеза АЛК. Хлорофильные оранжевые мутанты C. reinhardtii,накапливающие протопорфирин IX (ПП) удобны для изучения такой273регуляции, поскольку возможность накопления у них достаточно высокихуровней ПП обусловлена генетическим блоком превращения ПП впротохлорофиллид (ПХЛД) и, как следствие, отсутствием в их клеткахПХЛД – ретроингибитора синтеза АЛК.
У полученного нами в результатеУФ-мутагенеза мутанта chl1 коричневого штамма Н-19-25 усилениепродуктивности по ПП связано с увеличением уровня накопления АЛК, и,по-видимому, является следствием нарушения регуляции еѐ синтеза.Мутация mod-u-25, приводящая к усилению активности синтеза АЛК(вдвое) на фоне мутантных аллелей генов CHLH и LTS3: chl1 и lts3, имеетфенотипическое проявление – окраска колоний изменяется от оранжевой (уодиночных мутантов) до коричневой (у двойных мутантов). Также,мутантная аллель mod-u-25 обусловливает устойчивость несущих ее клетокк левулиновой кислоте (ЛК) в концентрации10 mM - летальной для клеток саллелью дикого типа.Энди Ванг [Wang, et al., 1975, 1977, Huang and Wang, 1986], изучаярегуляцию синтеза АЛК у хламидомонады, использовал мутант brs-1,накапливающий ПП, для получения более продуктивных по ПП штаммов, снарушенной регуляцией.
Были обнаружены два типа коричневых двойныхмутантов: равно чувствительные (как дикий тип или одиночный мутант) –brs-1,r1 и менее чувствительные – brs-1,db10 к ингибированию гемом, что ипозволило выделить два типа регуляции - аллостерическия и генетическая[Huang and Wang, 1986]. Мы показали, что мутаций: brs-1 и chl1 аллельны изатрагивают ген CHLH большой субъединицы магний-хелатазы (МХ).Однако, мутанты brs-1 и chl1 различаются по устойчивости к ЛК,отражающей уровень накопления АЛК (таблица 3.44).
Так, мутант brs-1обладаетпониженнымуровнемактивностиАЛК-синтезирующихферментов (24%) по сравнению со штаммом дикого типа, а у двойногомутанта: brs-1,r1 он восстанавливается до уровня дикого типа [Wang, et al.,1975]. Мутация mod-u-25 по нашим данным не влияет на чувствительность274ферментов синтеза АЛК к ингибированию гемом и не затрагивает реакциюобразования гема из ПП в отличие от описанных Э. Вангом мутаций: r1 иdb10 [Wang et al., 1977]. Сцепленное повышение в клетках двойногомутанта уровней накопления АЛК и гема может свидетельствовать обувеличении в результате этой мутации числа полиферментных комплексов,участвующих в синтезе порфиринов.В отличие от ядерной локализации мутации r1, осуществленный намигибридологический анализ двойных мутантовchl1,mod-u-25выявилхлоропластную природу мутации mod-u-25.
В отсутствие мутаций вядерном гене CHLH, хлоропластный детерминант mod-u-25 усиливаетактивность АЛК-синтезирующих ферментов на 40%, не влияя насодержание ХЛ. У одиночного мутанта chl1 синтез АЛК немного увеличен(по сравнению с диким типом), что может быть связано с отсутствием в ихклетках ПХЛД – ингибитора синтеза АЛК. Сам факт локадизации мутации,затрагивающей регуляцию синтеза АЛК, вхлоропластном геномепредставляется крайне интересным в плане формирования представлений ороли ядерных и хлоропластных генов в процессе биосинтеза ХЛ и биогенезахлоропластов. Известен один пластидный детерминант, непосредственноучаствуюший в синтезе АЛК - это ген, кодирующий глутаминовую тРНК(trnE). Все организмы, утилизирующие глутамат с образованием АЛКделают это с использованием тРНКGlu [Kannangara et al., 1988].
Роль этойтранспортной РНК состоит в обеспечении координированной регуляциихлоропластного и цитоплазматического белкового синтезов во времяформирования пластид. Геном хлоропласта C. reinhardtii секвенирован, илокализация мутации mod-u-25 в еѐ хлоропластной ДНК в дальнешем ещепредстоит.Взаимодействие ядра и хлоропластов фотосинтезирующей клеткиобеспечивается двойной системой генетической регуляции: кодируемыеядром белки и цитоплазматические факторы, поступая в хлоропласт, влияют275на экспрессию генов хлоропласта, а сигналы, генерируемые хлоропластом,регулируютэкспрессиюгеновядра(ретроградныйконтроль).Многочисленные исследования посвящены изучению кодируемых ядроммолекул, влияющих на экспрессию генов хлоропласта.
Активно ведутсяпоискифакторовпластид,такназываемых«сигнальныхмолекул»хлоропластного происхождения, которые регулируют экспрессию ядерныхгенов [Кулаева, 2001; Юрина и Одинцова, 2012; Ruckle, et al., 2007]. Умутантов растений и зеленых водорослей с нарушениями функцийхлоропластов, экспрессия ядерных генов, кодирующих белки фотосинтеза,репрессирована [Mayfield and Taylor, 1984]. Впервые этот феномен былописан при изучении пигментных мутантов ячменя albostrains и Saskatoon,листья которых имели белую или крапчатую (с белыми участками) окраску[Bradbeer et al., 1979]. Их хлоропласты были лишены рибосом, а активностькодируемых ядром генов биосинтеза ХЛ, - подавлена. Мутанты растений,лишенныекаротиноидов,-основныхфотопротекторовклетки,демонстрировали сходный фенотип: под воздействием света у них, врезультате индуцированного хлорофиллами фотоокисления, разрушаютсятилакоидныемембраныхлоропластов,ирезкоснижаетсяуровеньтранскрипции ядерных генов: CAB и RBCS - малой субъединицы Rubisco[Oelmuller, 1989].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
