Диссертация (1144823), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Для определения генетическойприроды реверсии штамм Brc-8 скрещивали с зеленым в темноте штаммомСС38, несущим аллель дикого типа по гену LTS3. Выживаемость зигот и спорв этом скрещивании СС1792 была достаточно высока (выше 50%), чтопозволилопроанализироватьпотомствометодомтетрадногоанализа(таблица 3.31). Появление сегрегантов мутантного фенотипа (формирующихв темноте колонии оранжевой окраски) в потомстве скрещивания двухзеленых штаммов (СС1792) свидетельствует, что мутация brc-1 сохраниласьв генотипе ревертанта Brc-8, а восстановление темнового биосинтеза ХЛпроизошло в результате еще одной (супрессорной) мутации в гене, которыйбыл назван SUP-3.
Анализ 126 тетрад скрещивания СС1792 показал, чтоколичество тетрад родительского дитипа (P) фенотипа: 4 зеленых : 0оранжевых (4 зел. : 0 ор.) значительно превосходит число тетраднеродительского дитипа (N) (фенотипа: 2 зел. : 2 ор.) и тетратипов (T)(фенотипа: 3 зел.
: 1 ор.). Расщепление 85P:16N:25T достоверно, свероятностью большей 99,999%, отличается от соотношения 1P:1N:4T,239характерного для случая независимого наследования генов. Данныеэксперимента позволяют сделать заключение о сцеплении мутаций brc-1 иsup3 и оценить расстояние между ними, которое составило 22,6 сМ.Таблица 3.31. Тетрадный анализ мейотического потомства скрещиванияСС 1792ШифрскрещиванияCC1792Родителиmt+mtBrc-8CC 38Генотипы родителейmt+mtbrc-1,sup-3 arg7pab2, ac14P:N:T*маркеры:brc1/sup385:16:25Расстояние(D)brc-1 - sup322,6 cMТаким образом, восстановление темнового синтеза ХЛ у спонтанногоревертанта Brc-8 произошло в результате возникновения мутации всупрессорном гене, сцепленном с исходной мутацией brc-1.Основным критерием определения типа генной супрессии являетсявыявлениеаллельнойспецифичностисупрессоров.Изтетрадынеродительского дитипа (N) в потомстве скрещивания СС1792 был выделензеленый в темноте и на свету сегрегант 1792-39а, содержащий супрессорнуюмутацию sup3 на фоне аллели дикого типа гена LTS3.
Этот штамм былподвергнут генетическому анализу для выяснения аллелоспецифичностисупрессорной мутации и уточнения данных по локализации гена SUP-3.3.4.3. Тетрадный анализ мутации sup-3Штамм 1792-39а (генотипа sup-3) скрещивали с мутантами, несущимиаллельные мутации в гене LTS3: brc-1 и lts3, соответственно, и анализировалипотомство этих скрещиваний методом тетрадного анализа (таблицы: 3.32,3.33). Сопоставление данных тетрадного анализа скрещиваний СС1810 иСС1811позволяетполучитьинформациюобаллелоспецифичностисупрессорного эффекта мутации sup-3. При еѐ отсутствии в потомстве240скрещиваний с участием обеих аллелей гена LTS3 (lts3 и brc-1) ожидаетсясходноедигенноерасщеплениеспоявлениемтрехтиповтетрад:родительского дитипа (2 зел.
: 2 ор.), неродительского дитипа (4 зел.: 0 ор.) итетратипов (3 зел..:1 ор.). В случае, если эта мутация супрессирует толькоодну из двух анализируемых аллелей – brc-1, расщепление по окраскеколоний в темноте в потомстве СС1811 (с участием аллели lts3) будетмоногенным (2 зел : 2 ор.).Таблица 3.32. Характеристика скрещиваний СС1810 и СС1811ШифрРодителискрещивания mtmt+СС1810Brc-3 1792-39aСС1811Lts31792-39aГенотипы родителейВыживаемость, %mtmt+зиготспорbrc-1sup3,arg7 pab266,088,0lts3sup3,arg7 pab254,072,0Таблица 3.33. Тетрадный анализ потомства скрещиваний СС1810 иСС1811Число типов тетрад в расщеплении по маркерам Дистанцияbrc1/sup-3скрещиванияbrc-1 - sup3P (2 ор.:2 зел.)N (0 ор.:4 зел.)T (1 ор.:3 зел.)СС181028211744,7 сМСС18113318336,1 сМШифрДанные таблицы 3.33 демонстрируют наличие класса зеленых тетрад (4зеленых : 0 оранжевых) в потомстве обоих скрещиваний, свидетельствуя, чтомутация sup-3 способна подавлять фенотипическое проявление обеиханализируемых мутантных аллелей гена LTS3, т.е.
ее супрессорный эффектне аллелоспецифичен. Отсутствие аллелоспецифичности при межгеннойсупрессии позволяет предполагать, что восстановление темнового синтезаХЛу ревертантаBrc-8моглопроизойтив результате включениядополнительного пути биосинтеза, альтернативного тому, который оказалсянарушенным исходной мутацией brc-1. Хотя по данным тетрадного анализа241скрещиваний СС1810 и СС1811 дистанция между генами LTS3 и SUP3несколько больше, чем генетическое расстояние, рассчитанное ранее (табл.3.31), они подтверждают прежние результаты об их сцеплении.
Соотношениятетрад в обоих случаях достоверно, с вероятностью 99,999%, отличаются отсоотношения 1P:1N:4T, характерного для независимо наследуемых генов.Увеличение значений, определяющих расстояния между этими генами, вчастности может быть результатом недостаточно большого объема выборкипосравнениюсоскрещиваниемСС1792илипреимущественнымвыживанием тетрад неродительского дитипа (фенотипа: 4 зел. : 0 ор.).3.4.4.
Анализ доминантности/рецессивности супрессорного эффектамутации sup-3Вегетативные клетки хламидомонады имеют гаплоидный наборхромосом,поэтомудлявыяснениядоминантности/рецессивностисупрессорного эффекта мутации sup-3 по отношению к исходной мутацииbrc-1былисконструированыгетерозиготныедиплоиды,пометоду,описанному В.Эберсольдом, с модификациями [Ebersold, 1967]. Для этогоскрещивали ауксотрофные по аргинину штаммы Brc-8 и Brc-3a, несущиепомимо brc-1 и sup3 комплементирующие мутации в гене ARG7 (arg7 и arg78), локализованном в первой группе сцепления хламидомонады, а затем насреде ТAP отбирали прототрофные вегетативные диплоиды, колонии которыхпоявлялись через 5 дней после начала эксперимента. Критериями плоидностислужили: размер клеток, который контролировали под микроскопом, и типспаривания - аллель mt- локуса типа спаривания доминирует в гетерозиготегенотипа: mt+/mt-. Диаметр диплоидных клеток приблизительно вдвоепревышал диаметр клеток гаплоидных штаммов хламидомонады, и все ониимели тип спаривания mt-.
Ожидалось, что в случае доминантного эффектамутации sup3 у диплоидов, гомозиготных по мутации brc-1, и гетерозиготныхпо sup3, светонезависимый биосинтез хлорофилла будет восстановлен, то242есть колонии таких диплоидов будут зелеными как в темноте, так и на свету.Если же супрессорный эффект мутации окажется рецессивным, тодиплоидные колонии сохранят фенотип исходного мутанта Brc-3 (оранжеваяокраска в темноте, зеленая на свету). В наших экспериментах колониидиплоидов, гетерозиготных по мутации sup3, и гомозиготных по мутации brc1 имели оранжевую окраску в темноте, демонстрируя, что супрессорныйэффект мутации sup-3 рецессивен по отношению к исходной мутации brc-1.Таким образом, генетические исследования ревертанта Brc-8, полученного отнакапливающего порфирины, неспособного синтезировать ХЛ в темнотемутантного по гену LTS3 штамма C.
reinhardtii, генотипа: brc-1, показало, чтовосстановление светонезависимого синтеза ХЛ у этого ревертанта произошлов результате рецессивной ядерной мутации sup-3. Эта мутация такжесупрессировала фенотипическое проявление другой мутантной аллели генаLTS3 – lts3, демонстрируя отсутствие аллелоспецифичности. Данныететрадного анализа позволяют сделать заключение о сцеплении мутаций sup3 и brc-1, и, следовательно, гены LTS3 и его супрессор SUP3 локализованы воднойхромосоме.Этагеннаясупрессия,по-видимому,связанасвозникновением альтеративного, заблокированному у мутанта Brc-1 путитемнового синтеза ХЛ. Возможно, что ген SUP-3 в норме репрессируетвключениедополнительного,светонезависимогосинтезаХЛ,существующегоамутациявsup3клеткепутивключаетэтотальтернативный механизм.
С учетом полученных нами сведений о природемутаций в гене LTS3, кодирующем фактор транскрипции семейства GATA,можно предположить, что в отсутствие нормально-функционирующегорегуляторатранскрипцииLTS3появляетсяинойпутьактивациитранскрипции генов биосинтеза ХЛ в темноте, который может бытьиндуцибельным и связанным с метаболизмом азота и углерода в клеткеводоросли. Для поиска таких факторов был применен генетический подход. Врезультате инсерционного мутагенеза зеленого в темноте спонтанного243ревертанта Brc-8 был получен обратный мутант Т8-3, у которого в результатеинсерции произошел возврат к фенотипу исходного бесхлорофильного втемноте мутанта Brc-1. Ниже представлены результаты изучения этоготрансформанта Т8-3 методами биохимии, генетики и молекулярнойбиологии. Локализация инсерции в ядерном геноме C.
reinhardtii позволилаобнаружить ген, экспрессия которого была блокирована вставкой, ипредположить функции кодируемого им белка.3.4.5. Получение инсерционного мутанта T8-3Культуру клеток спонтанного аргинин-зависимого ревертанта Brc-8генотипа: arg7-3,brc-1,sup-3 подвергли инсерционному мутагенезу (рисунок3.32). В результате трансформации клеток штамма Brc-8 вектором pCB412,содержащим аллель дикого типа гена ARG7, на среде ТАР в темноте былоотобрано 5148 клонов прототрофных трансформантов. Из них 5144 клонабыли зелеными в темноте и на свету как и трансформируемый штамм, а 4клона - имели желто-оранжевую окраску, сходную с окраской мутанта Brc-1.Мы предположили, что у них в результате инсерции произошло либовыключение супрессорного гена SUP-3 (восстанавливающего темновойсинтез ХЛ у ревертанта Brc-8), либо разрушение гена, продукт котороготакже необходим для супрессии эффекта мутации brc-1 в гене LTS3 втемноте.
Оранжевые прототрофные трансформанты в этом случае моглинести исходную мутацию brc-1. Один их этих четырех трансформантов,названный Т8-3 и стал предметом дальнейшего изучения. Наличие вставки вгеноме штамма T8-3 было подтверждено гибридизацией по Саузерну (данныенеприводятся)ивдальнейшем,прямымсеквенированием.Еслитрансформант Т8-3 является обратным мутантом, то есть в геноме ревертантаBrc-8 инсерцией оказалась инактивированной мутантная аллель гена Sup-3,продукт которого супрессировал эффект мутации brc-1, то фенотип штамма244Рисунок 3.32. Схема получения трансформанта Т8-3Т8-3 будет определяться наличием этой мутации в гене LTS3. Длявыяснения вопроса, произошел ли в клетках трансформанта Т8-3 возврат кфенотипу исходного штамма Brc-1, изучали его фенотип и генотип.3.4.6.
Фенотип инсерционного мутанта T8-3Темновые культуры клеток мутанта Т8-3 желто-оранжевые, и поокраске неотличимы от культур исходного мутанта Brc-1. Различия междуними были выявлены в условиях освещения. Оказалось, что трансформантутратил способность расти и зеленеть на свету в фототрофных (рисунок3.33). Результаты изучения пигментного состава клеток трансформанта Т8-3,исходного ревертанта Brc-8, мутанта Brc-1 и штамма дикого типа СС124,представлены в таблице 3.34. Установлено, что клетки трансформанта, такжеT8-3Brc-8CC124Рисунок 3.33. Рост культур клеток мутанта Т8-3, ревертанта Brc-8и штамма дикого типа СС124 на свету на среде без ацетата ( Т)245как и клетки мутанта Brc-1, в темноте накапливают протопорфирин IX (ПП)и его магниевые производные: Mg-протопорфирин IX (Mg-ПП) и Mgпротоморфиринхлорофиллов.IX-монометиловыйТакимобразом,эфирфенотиписледовыетрансформантаколичествавтемнотесоответствовал фенотипу исходного мутанта brc-1 по гену LTS3.Таблица 3.34.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
