Диссертация (1144823), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Молекулярное клонирование гена LTS3позволило установить его местоположение на хромосоме I (рис. 3.25). Всоответствии с версией 4 геномного сиквенса C. reinhardtii (http://genome.jgipsf.org/Chlre4/Chlre4.home.html),chromosome_1:3697097-3698067.находится в позиции: 3697129-31.онлокализованИнициирующийвкодонположении:(ATG)гена213>Chlre4chromosome_1:3696006-36984665'pad=03'pad=0strand=+3,696,126 GCTCATTCAGCTGCGTGGCCACCGACACGCTGCCGATAGACTTCAGCCTGGGCTACGGCG 3,696,1853,696,186 ACGGCGCGCTCATGGGCGCTAGCTGCAGCGGCGGCGGCCTTGCGTTCGGCTCGCGCGGCC 3,696,2453,696,246 GCAGCGCCAGCCTGAACGAGACGCACCTGCGGCGGCAGCAGTGGCTGCACGAGGGCGAGC 3,696,3053,696,306 TATTGGCGCCGCAGCTGCCACCCAGCGTCAGCGAGCTGGAGCTGCTGGAGCTGCCGGAGG 3,696,3653,696,366 ACCCAGTGCCGCTGCGGCCCTTCAAGTGCGCGTCCTTCCTCGGCGGCCTCAACACCATGG 3,696,4253,696,426 CCGATAGCTCGCTGACCGCGAGCGCGGCAGCGGCGGCCAACGCCGCCGCGGTGCGCCCCA 3,696,4853,696,486 TGACGTCTGGCATGATGCAGTTCAAGGGCGCTGGCGCCGCGGCCGGCGTGGACGCGGGCG 3,696,5453,696,546 CTGCTGCCGCGGTGGCCACCACGACCACCACCACCACGACTACCAACAACGGCGTCACGG 3,696,6053,696,606 TGACCGTGAAGCGTAAGATTATCACCTCGCCCAGCCCGCTTCTGCAGCAGGGAAAGGGCA 3,696,6653,696,666 AGACGCGCCAGCCTGCCGGGCCCGCCGCCGTGGCCCCCGCGGGCGTAAACTTGCAAAGCC 3,696,7253,696,726 CTAAGCGCGCCAAGGTGGGCGGCAGCAGCGGCTTCGGCGGCTGGCAGCAGCCGGGTGCCG 3,696,7853,696,786 GCGGCATGAAGGTGGTACGCAGCGTGCCCAGCAACATGAACAACTTCCTTGAGGGCGTCG 3,696,8453,696,846 AGGTGACGGTTCAGCCCATGGGGCACGCCGGCGCAGACTCGGTGGTCAGCCCCAACGCCA 3,696,9053,696,906 GCTCCATTTCGGCATCCACGCCCAACGCGCAGTTTGGCGCCGGCCCATTCTTTGACCCGG 3,696,9653,696,966 CTGCTGCTGCGCGCGGAGGCTCCGCGTTGGCCGCCGGCATGCTCGCGCCGCAGGCGGTGG 3,697,0253,697,026 CATCCGCCGCCGGCAGGGGCAGCAAGAGCAAGGTGGCCGTGCCGCCTACCGGCGTTTCAG 3,697,0853,697,086TGCCGGTGCCGCCGGTGCAGGGCGTGGGGCCGGTACCGCCTGGCATGATCCCTGGCCTGG3,697,1453,697,146TGCCCGGCACTTTCATGGCTCCTGGCATGGCCTTCCCCGAGGGTGAGCGAATGTTATTTT3,697,2053,697,206 GACACCTGTACGGTTGGTTGCCTTGTTGCACAGCATGGCATGCTGTGCCAGGAAGGGCGC 3,697,2653,697,266CCGATTGGTATGCCTTGTCAACAGCATGTCTCTTTGCGGATACCTAACCCAGCATTGCCG3,697,3253,697,326 TGCCTTCTGACCCCGCAGCCAAGCGCCCTGTGCCGTCGGTGCCGAAGCCGCGCAAGCGCG 3,697,3853,697,386 CCTCGCCCAATGGCAACCCGCCGAAGGCGCCTGCACCCAACCCGAACGGCCACTGCTGCA 3,697,4453,697,446 CCCAGTGCGGCACGCAGACCACGCCCGTTTGGCGCGCGGGCCCGCACGGCCCCAAGACGC 3,697,5053,697,506 TCTGCAACGCCTGCGGTGTCCGGTATATGAAGGTTGCCAAGTCGGGCGCCACGCAGCCGG 3,697,5653,697,566CTCCGAGGCGGCAGCAGCAGCAGCATCACCAGTAGCACGCTGTGGCGGGCTACATGGCCG3,697,6253,697,626 GCAGCGATAGTACGGAGCGTGCGGCGTCCTGCGGGCAGCGGCACGGCTTCCCAAATGCAC 3,697,6853,697,686 AGCGGTTGTCCTCCGCGACATGCCCCTGAATGGGTGCTGGTCAAGGCAGAGCAACTGAGC 3,697,7453,697,746 GCGCGTTGTAGGTTACGGGATGTGCATGTGGACTAAACTGGTGAGGCCTGAATGGTGGGT 3,697,8053,697,806 TGTGCCAAAGGCCGTGCAGGAGTGCTTGACGCGCGCTCCCACGTTGATGGTCGTGCACCG 3,697,8653,697,866 ACAATACGGTGGGGCCGGGGCAACATGTGTTGTTGGTTGCCGCGTTTGGCAACGTGGTGG 3,697,9253,697,926 TTGTTTGGATGGCTGTGGGCGCGATTTGTTCGTATGCGCCAGTAACAACAGGAAAGCGTG 3,697,9853,697,986 CACGTGTATGATTTACGACAACCGGGATTAACATTACCACCGCATGCAGCTGGGGACCCA 3,698,0453,698,046 TATGAACTGGCGTGCGATCTTGTTGCTCCTTGCCTTACAGCGCACCATGCGCGCGCATGA 3,698,1053,698,106 GGTGTGGCGCAACTCCGCTAGCCGCTGGATTGGGCGTTGGACTTAGACGGAACTCGGCTG 3,698,165Рисунок 3.25.
Нуклеотидная последовательность гена LTS3. Синим цветомобозначены нетранслируемые участки: 5‘UTR и 3‘UTR; фиолетовым – интрон,красным – кодирующая последовательность. Стартовый кодон и стоп кодон –врамке; сигнал полиаденилирования – подчеркнут. Мотивы GATA и TATC (втораяцепь) – желтым и малиновым, соответственно. CRE-элемент (TGACGTCT) –выделен зеленымБелок LTS3 в базе данных геномного проекта C. reinhardtii(http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispCeneModel/Chlre3.home.html)обозначенкак ID 171659. Он состоит из 104 аминокислотных остатков (ак), и имеетмолекулярную массу 11,067 kDa. Виртуальный анализ структуры этогобелка, осуществленный с использованием программ, доступных на сайтеExPasy tool (http://expasy.org/tools/scanprosite, together with ProRule-basedpredicted intra-domain features) позволил обнаружить в его составе один ДНК-214связывающий домен (рисунок 3.26) со структурой «цинкового пальца»,сходный с доменами транскрипционных факторов, относящихся к семействуGATA (ZnF_GATA).
Цинковый палец, расположенный ближе к С-концумолекулы (54 аа – 78 аа), имеет каноническую конфигурацию: Cys-X2-CysX18 – Cys-X2-Cys , петля которого, состоит из 18 аминокислотных остатков.Он узнает консенсусную последовательность ДНК: WGATAR (где W-A/T, аR – A/G).Рисунок 3.26. Доменная структура белка LTS3 (104 ак.).
Аминокислоты,формирующие структуру цинкового пальца, выделены синим цветом.Анализ нуклеотидной последовательности 5‘фланкирующего районаДНК выше по течению от точки начала транскрипции гена LTS3 (рисунок3.25)позволилобнаружитьцис-действующиеэлементы:GATA-последовательности, характерные для промоторов светоиндуцируемых генов,и последовательность CRE (cAMP response element) соответствующуюпалиндрому: 5‘ TGACGTCT 3‘, которые участвуют в регуляции экспрессиигенов в ответ на ограничение по источникам азота и углерода [Соколовский иБелозерская, 2000].
Первый GATA–мотив найден выше по течению вположении: 3696160 – 3696163, на расстоянии в 926 нуклеотидов от точкиначала транскрипции. Второй GATA-мотив (CGATAG) - обнаружен вположении:-668-655вышепотечениюиодинмотивTATC(комплементарный GATA –вторая цепь) – в позиции: -461-458.
Начало CRE–элемента лежит в положении 3696486, на расстоянии 610 нуклеотидов выше215по течению. Наличие GATA-элементов в промоторной области гена LTS3позволяет предположить его способность к авторегуляции, а мотив CREсвидетельствует о том, что его экспрессия может зависеть от источниковазота и углерода.3.3.9. Мутантные аллели гена LTS3Секвенирование мутантных аллелей brc-1 и lts3 гена LTS3 позволилоустановитьмутационныенарушениявихнуклеотидныхпоследовательностях. Мутантные аллели гена LTS3 были амплифицированыс использованием ген-специфичных праймеров (таблица 3.27). Матрицамислужили геномная ДНК (gDNA) и кДНК (cDNA) из клеток мутантов brc-1,lts3 и штамма дикого типа.
Полученные ДНК-фрагменты были клонированыв составе плазмид pJET1 и секвенированы. Секвенирование обеих мутантныхаллелей: brc1 и lts3 показало, что они несут мутации во втором экзоне генаТаблица 3.27. Праймеры, использованные для амплификации гена LTS3Шифр5’ - 3’ последовательностьtmМатрицаАмпликонLts3-1fGAGCAAGGTGGCCGTGCCG66 Геномная ДНК1,080 пн(1f-1)Lts3-1rCATGGTGCGCTGTAAGGCAAG64Lts3-1fGAGCAAGGTGGCCGTGCCG66 кДНК401 пн (1f-2r)Lts3-r2CAGCGTGCTACTGGTGATG64 Геномная ДНК557 пн (1f-2r)Lts3-f2CGGCACTTTCATGGCTCGTG64 кДНК300 пн(f2-r2)Lts3-r2CAGCGTGCTACTGGTGATG64Z-LtsAGCCGCGCAAGCGCGCCTCGC76JOEBHQ2*Cblp-f GCCACACCGAGTGGGTGTCGTGCG74 кДНК291 пн*Cblp-r CCTTGCCGCCCGAGGCGCACAGCG78**Tub1 GAGTTCACTGAGGCCGAGTC64 кДНК200 пн**Tub2 TCCTTTGTCCAGGGTCAGTC62*CBLP - референсный ген, используемый в качестве контроля при ОТ-ПЦР; он кодируеткомпонент цитоплазматических 40S рибосом RACK1 (XM_001698013).**Tub2 – (beta-2 tubulin) референсный ген, используемый в качестве контроля приОТ-ПЦР Chlamydomonasreinhardtii.216LTS3.
Мутация brc1 является вставкой нуклеотида T в позиции 119+, амутация lts3 представляет собой делецию 2-х нуклеотидов в положении 160163 на кДНК гена LTS3. Обе мутации приводят к сдвигу рамки считывания исинтезу белков, не содержащих GATA-домен (таблица 3.28).Таблица 3.28. Результаты виртуальной трансляции аллеля дикого типа(wt) и мутантных аллелей lts3 и brc-1 гена LTS3БелокАминокислотная последовательностьLTS3MIPGLVPGTFMAPGMAFPEAKRPVPSVPKPRKRASPNGNPPKwtGATAмотив*естьAPAPNPNGHCCTQCGTQTTPVWRAGPHGPKTLCNACGVRYMKVAKSGATQPAPRRQQQQHHQbrc-1 MIPGLVPGTFMAPGMAFPEAKRPVPSVPNAAQARLAQWQPAEGACTQPERPLLHPVRHADHARLARGPARPQDALQRLRCPVYEGCQVGRHAAGSEAAAAAASPVARCGGLHGRQRMIPGLVPGTFMAPGMAFPEAKRPVPSVPKPRKRASPNGNPPKPClts3TQPERPLLHPVRHADHARLARGPARPQDALQRLRCPVYEGCQVGRHAAGSEAAAAAASPVARCGGLHGRQR*GATA-мотив – С-X(2)-C-X(17/18)-C-X2-Cнетнет3.3.10.
Экспрессия гена LTS3После молекулярной идентификации гена LTS3 ставилась задача изученияего экспрессии на уровне транскрипции. Из клеток мутантов (brc-1 и lts3), иштамма дикого типа (СС124), культивируемых в различных условияхосвещения: в темноте, на постоянном свету и при переносе клеток изтемноты на свет, была выделена РНК. На ее основе, методами обратнойтранскрипции с использованием олиго-dT-праймеров были получены кДНК,которые служили матрицами для амплификации c ген-специфичнымипраймерами фрагментов кДНК гена LTS3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
