Диссертация (1144823), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Также, у неспособных синтезировать ХЛ в темнотемутантов хламидомонады (lts3 и y-7) транскрипция ядерных генов, кодирующихферменты биосинтеза ХЛ, в темноте репрессирована как у большинствапокрытосеменных растений.Рисунок 3.22. Иммуноблотинг белков CHLH и CHLI магний-хелатазы С.reinhardtii. Клетки штамма СС124дикого типа и мутанта Lts3 выращены в темноте(ПТ), при освещении темновых культур и на свету ( ПС). Контроль – СRP - пробы кбелку plRpLl рибосом хлоропластов3.3.6. Картирование гена LTS3Для локализации LTS3 на генетической карте Chlamydomonas reinhardtiiмутанты по этому гену скрещивали с маркерами различных групп сцепления (ГЦ)и анализировали потомство методом тетрадного анализа. Ранее полученныеданные (подраздел 3.1), указывали на независимое наследование мутации lts3 имаркеров VI, X и XI ГЦ и ее слабом сцеплении с дистальным маркером msr1первой ГЦ (29PD:7ND:30T), далее именуемой хромосомой.
Картирование генаLTS3 было осуществлено по результатам тетрадного анализа расщеплений впотомстве скрещиваний мутанта на штаммы-маркеры правого плеча хромосомы I(таблица 3.24).Оценки их сцепления позволили локализовать ген LTS3 вхромосоме I хламидомонады на расстоянии 0,34 сМ от маркера ac115, в 28-30 сМот центромеры (рисунок 3.23).208Таблица 3.24. Тетрадный анализ зигот скрещиваний мутанта lts3 смаркерами группы сцепления I C. reinhardtii и центромерными маркерамиПарыP:N:TDПары маркеров: ген - центромерамаркеров(сМ)маркерыPD:ND:TD (сМ)lts3 / arg772:2:129,3lts3/pf2*7:7:1828,1lts3/ac1413:0:717,5lts3/n+1**6:11:2630,2lts3/pab2173:1:21,1arg7/y-6*45:0:4023,5lts3/ac115145:0:10,3*pf2 –центромерный маркер ГЦ XI; y-6 – центромерный маркер ГЦ I.D- расстояние между маркерами, определенное по формуле:D(сМ) = (N+0,5T)/(P+N+T)x100, где: P, N, T – родительский дитип, неродительский дитип итетратип, соответственно (Harris, 1989).**Приведены результаты расщепления трисомика (++-)по ГЦ I.
Анеуплоидия используется как центромерный маркер и позволяет оценить расстояниеген-центромер как ½ частоты тетратипов.Рисунок 3.23. Генетическое и молекулярное картирование гена LTS3 в группесцепления I и в геноме хламидомонады. Расстояние между маркерами нафрагменте генетической карты (группа сцепления I) указаны в сантиморганах.Положение маркеров на участке ДНК хромосомы I обозначены порядковымномером нуклеотидов скаффолда I.
Фрагменты геномной ДНК из библиотекиBAC-клонов, использованные в работе, перекрывают участок скаффолда 1(позиции: 1853 - 3704 тпн). Позиции фрагментов, содержащих аллели дикого типагенов LTS3 и Ac115 указаны курсивом3.3.7. Позиционное клонирование гена LTS3Поиск гена LTS3 в геноме Chlamydomonas reinhardtii был осуществлен методамипозиционного клонирования и геномной комплементации, применение которыхвозможно в случае известной локализации искомого гена на генетической карте209объекта.
Метод состоит в использовании фрагментов геномной ДНК из штаммадикого типа в составе библиотеки BAC-клонов для трансформации мутантныхкультур [Rymarquis, 2005]. У трансформантов фенотипа дикого типа компенсациямутантной аллели происходит за счет привнесенного фрагмента ДНК, который,затем, служит предметом поиска гена интереса.
Практически все фрагменты ДНКиз геномной библиотеки BAC-клонов хламидомонады имеют «привязку» кконкретным участкам генетической и физической карт C. reinhardtii, и, знаяположение гена на этих картах, можно подобрать клоны, которые с большойдолей вероятности содержат фрагмент ДНК, соответствующий искомому участкухромосомы. Мы картировали ген LTS3 в группе сцепления I, и в базе данныхгеномного проекта хламидомонады (http://genome.jgi-psf.org/) провели поискBAC-клонов, которые могут нести ДНК участка хромосомы I, содержащего генLTS3. Для экспериментов по трансформации были выбраны 25 клонов (таблица3.25), суммарно перекрывающих (по геномной ДНК) область вероятнойлокализации гена LTS3 длиной ок.
1850 тпн приблизительно равную 15 сМ.Зеленые в темноте устойчивые к хлорамфениколу трансформанты были полученытолько в экспериментах, где в качестве трансформируемого материалаиспользовали геномную ДНК двух BAC-клонов: PTQ9626 и PTQ4402. Частотыих появления оказались сходными при трансформации мутантов BAC-ДНК обоихклонови в среднем составили 0,7х10-7 и 1,4х10-7 для мутантов brc-1 и lts3,соответственно. Два BAC-клона, ДНК которых компенсировала мутантные аллелигена LTS3, несли перекрывающиеся последовательности. Это означало, чтообщий для обоих клонов фрагмент ДНК размером 11900 пн, содержит аллельдикого типа гена LTS3. При сопоставлении нуклеотидных последовательностейгеномной ДНК, мРНК и EST-клонов в составе этого фрагмента хромосомы I былообнаружено три открытые рамки считывания (рисунок 3.24).210Таблица 3.25.
Клоны из библиотеки BAC-клонов C. reinhardtii,использованные в работеPTQ№ клона граница граница Размер (тпн)962626m518534961949182 95689440212c2219374132012699 75286707919m1821001422249357 149215382810h1124214032511909 90506клонов, представленных на 4014544 38p1224536482555787 102176чашках,648017p1225375692608200 70631содержит 384 клона.
Нумерация724719n1225883292664468 76179клонов определяется номером23807g1926653382751600 86262чашки,11174 30k927033762774837 7146127698a2127726032873176 100573679718j1928120052866622 54617791121n928453002912365 6706531589k2128668262978807 111981715619h1329976713052605 54934дикого типа гена LTS3 (PTQ:10208 27p730392293161492 1222639626? 4402) и аллель дикого472713m630775473161505 83956типа гена Ac115 (PTQ14544).32889p531417943188241 4644710734 28l2031882523229167 4091512782 34k432801173360784 8066711273 30a1233916553423603 3194830608h2233916403456971 6531614506 38d434078743467932 60058678818h1734738463562269 8842314290 38c2135631943591002 2780814282 38c193587669- 3703690 106021PTQ - нумерация BAC-клоновв каталоге JGI№клонавкаждаябиблиотекеизкоторыхбуквеннымобозначением ряда (от А до Р) иномеромЖирнымколонкишрифтом(1-24).выделеныBAC-клоны, содержащие аллель211Рисунок 3.24.
Область перекрывания ВАС–клонов (фрагмент ДНКразмером 1,9 тпн), и структура гена LTS3 (длина - 815 пн, включает 1 интрон(156 пн). На схеме указаны инициирующий кодон (ATG) и стоп-кодон (TGA)В результате анализа рестрикционных карт генов-кандидатов были выбраныэндонуклеазы рестрикции, специфически режущие их ДНК, и, далее,мутанты по гену LTS3 трансформировали материалом ДНК BAC-клонов:PTQ9626 и PTQ4402, обработанные рестриктазами: HindIII, BamH, Pst1, SphI(таблица 3.26).
Отсутствие зеленых в темноте трансформантов былоустановлено только в экспериментах, в которых использовали BAC-ДНК,Таблица 3.26. Трансформация мутантов по гену LTS3ДНК ВАС клонов PTQ9626 и PTQ4402, обработанных рестриктазами *РестриктазыПоложение сайтов рестрикцииРезультатыHindIII118, 6228, 11914+BamHI164, 1968, 110010+PstI451, 1559, 1815, 5804, 7183, 8221, 8660+SphI2082, 6458, 7854, 9015, 9256, 10040, 11227-*- знак (+) в графе результаты означает, что при трансформации появлялисьзеленые в темноте клоны, свидетельствуя, что данные эндонуклеазы рестрикции ненарушают целостности аллели дикого типа гена LTS3.212порезаннуюрестриктазойSphI.Этирезультатыдавалиоснованиепредположить, что ген LTS3 на фрагменте ДНК размером 11.9 тпнсоответствует транскрипту, занимающему положение: 9106-10076 (рисунок3.24).3.3.8. Структура гена LTS3 и кодируемого им белкаАнализ структуры гена LTS3 (рисунки: 3.24, 3.25) был проведен путемсопоставления нуклеотидной последовательности геномного фрагмента исоответствующих ему последовательностей мРНК и EST-клонов, из базыданных геномного проекта хламидомонады (http://genome.jgi-psf.org/cgibin/dispCeneModel/ ).
Поиск открытой рамки считывания (ОРС) вели также спомощью адаптированной для хламидомонады программы GreenGenie2(http://bifrost.wustl.edu/GreenGenie2), которая находит ОРС в геномномсиквенсе. В результате, по данным компьютерного анализа установлено, чтоген LTS3 содержит 2 экзона (58 пн и и 257 пн) и 1 интрон (156 пн). Еготранскрипт размером 815 пн включает короткий (33 пн) 5‘- нетранслируемыйрайон (5‘UTR), открытую рамку считывания ОРС (315 пн), кодирующуюбелок размером 104 ак, и длинный (467 пн) 3‘нетранслируемый участок(3‘UTR).
Его стоп кодон – TAG встречается в 15% исследованных геновхламидомонады (также как и TGA), тогда как у большинства из них вкачестве нетранслируемого кодона выступает триплет TAA. Сигналомполиаденилирования транскрипта LTS3 служит последовательность TGTTG,тогда как наиболее типичными для C. reinhardtii. являются: TGTAA, TGTAGи TGTTA [Rochaix et al., 1998].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
