Диссертация (1144823), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Эти данныепозволили предположить, что активности МХ и АЛК-синтезирующегокомплекса в темноте зависят от наличия продукта гена LTS3.Выращенные в темноте проростки высших растений - желтые. Ониимеют недифференцированные пластиды, называемые этиопластами, несинтезируют хлорофилл и накапливают протохлорофиллид (ПХЛД).
Послеосвещения в их клетках запускается процесс зеленения: активируетсяэкспрессия генов, кодирующих белки, задействованные в процессах223фотосинтеза, из этиопластов формируются хлоропласты, и образуетсяхлорофилл [Armstrong, 1998]. Клетки штаммов дикого типа хламидомонады,растущие гетеротрофно, обладают хорошо развитой системой хлоропластныхмембран и способны к образованию хлорофилла, а мутанты yellow подобныэтиолированным проросткам высших растений.
Выращенные в темноте, ихклетки содержат слабо структурированные хлоропластные мембраны инакапливают ПХЛД, а после освещения, синтез хлорофилла, также как иструктура тилакоидных мембран у них полностью восстанавливаются втечение 6-8 часов [Li, 1996]. Штаммы хламидомонады brc-1 и lts3, имеютсходное с yellow строение хлоропластных мембран [Wang, 1978; Grimm,личное сообщение]. Для ответа на вопрос, сохраняется ли сходство мутантовпри зеленении, мы изучили этот процесс и показали, что для мутантов погену LTS3 характерна временная задержка индуцированного светом синтезаХЛ.
По-видимому, освещение сначала ведет к уменьшению содержанияпорфириновых интермедиатов, после чего начинается процесс биосинтезахлорофиллов. Такая последовательность событий, описанная ранее длямутанта brc-1[Wang et al., 1974],оказалась характерной для мутанта lts3.Очевидно, свет снимает эффект мутаций, - выращенные в темноте мутантыпо гену LTS3 перестают накапливать протопорфирины, и их клетки, вновьобразованные в результате деления, становятся способны к синтезухлорофиллов.
На основании этих наблюдений предположили, что продуктгена LTS3 необходим для работы магний-хелатазы в темноте, и участвуетв световой регуляции ферментов биосинтеза хлорофилла.В этой связи возникла необходимость изучить влияние мутации в генеLTS3 на экспрессию генов, кодирующих МХ и другие ферменты биосинтезахлорофилла. У покрытосеменных растений гены, кодирующие белкифотосинтеза (БФ), регулируются светом на уровне транскрипции. Уровень ихмРНК крайне низок в тканях, культивируемых в темноте, и быстроувеличивается при освещении. У голосеменных, способных к темновому224синтезу хлорофиллов, такая зависимость выражена слабо.
В их клеткахмРНК целого ряда генов БФ активно нарабатываются в отсутствие света, иих количество лишь слегка увеличивается при переносе растений на свет[Ohad, 1967]. Методом Нозерн-блот анализа мы показали, что у мутанта погену LTS3 по сравнению с клетками дикого типа в темноте сниженатранскрипция генов, кодирующих МХ и фермента GSA-AT, входящего всостав АЛК-синтезирующего комплекса. Синтез белков большой (H) и малой(I) субъединиц МХ у штамма дикого типа и мутанта lts3 полностьюсоответствует динамике накопления мРНК этих генов, свидетельствуя, чторегуляцияихэкспрессиипроисходитнауровнетранскрипции.Установленный нами характер экспрессии генов, кодирующих ферментыбиосинтеза хлорофилла, соответствует уровню активности анализируемыхферментов и отражает динамику синтеза хлорофиллов в процессе зеленениякультур мутантов хламидомонады.
Световая индукция транскрипции этихядерных генов наблюдается как в клетках штамма дикого типа, так ибесхлорофильных в темноте мутантов. Различия состоят в снижении ихэкспрессии у мутанта lts3 в темноте и на ранних стадиях зеленения.Результаты исследований пигментного состава, процесса зеленения,активности ферментов биосинтеза хлорофиллов и экспрессии кодирующихихгеновуанализируемыхмутантовхламидомонадыпозволялипредположить, что мутации в гене LTS3 влияют на регуляцию биосинтезахлорофиллов на уровне транскрипции.
Продукт гена LTS3 в темнотеактивирует экспрессию ядерных генов, кодирующих МХ (CHLH, CHLD иCHLI) и глютамат-полуальдегидаминотрансферазу (GSA-AT).Для поиска гена LTS3 в геноме хламидомонады была выбранастратегия позиционного клонирования, которая применяется в случаях, когдаген картирован, но неизвестны функции кодируемого им белка. Полученныенами данные о локализации LTS3 были использованы в экспериментах погеномной комплементации.
В результате, в библиотеке BAC-клонов225хламидомонады был найден фрагмент ДНК, содержащий аллель дикого типагена LTS3. Компьютерный анализ структуры гена и аминокислотнойпоследовательности кодируемого им белка позволили установить, что онкодирует транскрипционный фактор семейства GATA. В этой связи, нашипредположения о функциях белка LTS3 как регулятора транскрипции нашлисвое подтверждение.
Дальнейшие исследования - анализ промоторнойобласти гена LTS3, секвенирование мутантных аллелей этого гена и изучениеего экспрессии – были направлены на выяснение функций кодируемого имбелка. Было установлено, что результатом мутаций brc-1 и lts3 в гене LTS3стало отсутствие GATA-цинк-пальцевых структур у мутантных белков. Повидимому, утрата функции ДНК-связывания белков LTS3 и являетсяпричиной мутантного фенотипа – неспособности клеток к темновомубиосинтезу хлорофилла, а основная работа фактора LTS3 состоит всвязывании цис-действующих участков ДНК в промоторных областяхядерных генов.Методом ОТ-ПЦР изучена экспрессия гена LTS3 в клетках мутантов поэтому гену и штамма дикого типа (рисунок 3.28), и показано, что свет внорме репрессирует, а наличие ацетата в среде ˗ активирует еготранскрипционную активность.
По-видимому, продукт гена LTS3 необходимклетке в условиях гетеротрофного роста. У мутантов экспрессия этого генаснижена и в темноте и на свету, свидетельствуя, что мутации в гене LTS3нарушают регуляцию его собственной экспрессии. По-видимому, факторLTS3 обладает свойством авторегуляции - контролирует экспрессиюкодирующего его гена на уровне транскрипции. Для поиска элементовсвязывания Zn-F_GATA домена был проведен анализ ДНК 5‘фланкирующегорайона от точки начала транскрипции гена LTS3.
Он позволил обнаружитьцис-действующие элементы: две GATA-последовательности, характерныедля промоторов свето-индуцируемых генов, и последовательность CRE(cAMP response element, - 5‘ TGACGTCA 3"), для которой показано участие в226регуляции экспрессии генов в ответ на ограничение по источникам азота иуглерода [Соколовский В.Ю., Белозерская Т.А, 2000]. Наличие в промоторегена LTS3 участков связывания кодируемого им белка наряду с результатамиизученияэкспрессииэтогогенасвидетельствуютовозможностисаморегуляции его транскрипции. Авторегуляция описана для значительногочисла транскрипционных факторов [Bateman E., 1998], и ее существование угена LTS3 также позволяет отнести кодируемый им белок к факторамтранскрипции, обладающим свойством авторегуляции.
Отвечая на вопрос, ˗каким образом фактор LTS3 влияет на экспрессию генов, кодирующихферменты биосинтеза хлорофилла: МХ и GSA-AT, мы предположили, что онвыступает в роли активатора экспрессии кодирующих их генов: CHLH,CHLD, CHLI и GSA в темноте, и необходим для их световой индукции.БелкисемействаGATAявляютсярегуляторнымифакторамитранскрипции. Они есть только у эукариот, включая позвоночных,беспозвоночных, растения и грибы [Brewer, 2006; Manfield et al., 2007;Соколовский, 2000].
Впервые они были обнаружены у позвоночных какэритроид-специфичные транскрипционные факторы. Эти белки содержат двацинковых пальца конфигурации: Cys–X2–Cys–X17-Cys–X2–Cys (где X —любая аминокислота), которые взаимодействуют с мотивом WGATAR (W =TorA; R = GorA) по большой бороздке ДНК [Evans and Felsenfeld, 1988;Martin and Orkin, 1990].У модельного объекта биохимической генетикигриба нейроспорыNeurospora crassa к семейству GATA–факторов относятся такие жизненноважные белки, как: NIT2, WC1 и WC2.
Все они имеют один цинковый палецсконсенсуснойпоследовательностью:Cys–X2–Cys–X18-Cys–X2–Cys[Соколовский и Белозерская, 2000]. Ген NIT2 кодирует фактор транскрипцииNIT2 - основной регулятор азотного метаболизма у N. сrassa. Мутации поэтому гену приводят к частичному или полному ингибированию дерепрессиигенов азотного цикла при недостатке первичных источников азота: нитратов,227солей аммония и аминокислот [Marshall and Timberlake, 1991].
Эти фактыпозволили заключить, что NIT2 кодирует транс–действующий регуляторныйбелок NIT2, активный в условиях азотного голодания, который отвечает заселективную индукцию многих генов, и функционирует через цис–действующие элементы GATA в их промоторах. Уровень активацииэкспрессиизависит, по-видимому, оторганизации и числа элементовузнавания NIT2 в промоторах регулируемых генов [Fu and Marzluf, 1990;Marzluf, 1997].
Нативные NIT2–связывающие участки в промоторныхрайонах регулируемых им генов значительно отличаются по ориентации,локализации и нуклеотидной последовательности. Большинство NIT2–связывающих районов содержат два или более близко расположенных копийосновного (core) элемента – GATA, который обычно узнается белкамисемейства GATA–факторов.
Одиночные последовательности GATA являютсяучастками слабого связывания для NIT2. Два (или более) элемента GATA,локализованные на расстоянии до 30 пар нуклеотидов друг от друга инаправленных в одном или противоположных направлениях, составляютучасток сильного связывания NIT2. Замена любого из нуклеотидов основногоэлемента GATA значительно уменьшает или уничтожает связывание NIT2 заодним исключением – последовательность GATT сохраняет около 50%связывающей активности родительского элемента GATA [Marzluf, 1997].Видимый свет является экологическим фактором, регулирующимжизненно важные функции для многих гетеротрофных микроорганизмов,включая грибы. У оранжевой хлебной плесени нейроспоры свет синефиолетовой области спектра регулирует индукцию синтеза каротиноидов,половой процесс и циркадные ритмы [Idnurm and Heitman, 2005].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
