Диссертация (1144823), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Эта вставка приводит к мутации типа―fraimshift‖ - сдвиг рамки считывания, обусловливая появление стоп-кодона через22 триплета нуклеотидов. В результате, в клетках мутанта синтезируетсякороткий пептид размером 479 ак (52 kDa). Он не детектируется при Вестерн-блотанализе, по-видимому, из-за нестабильности этого белка.Поскольку в потомстве зигот скрещиваний мутантов chl1 и brs-1 не наблюдалипоявления рекомбинантов среди более чем 104 проанализированных клонов(подраздел 3.1.2), мы ожидали обнаружить мутацию brs-1 на расстоянии, не183превышающем 1 тпн от мутации chl1.
В геноме C. reinhardtii на 2 сМ единицрекомбинации приходится 150 – 200 тпн генома. Поскольку в единицахрекомбинации расстояние между мутациями оценивается как 0,01 сМ, вединицах генома оно не должно превышать 1000 пн. Частичное секвенированиеДНК гена CHLH из штамма brs-1 выявило мутацию – вставку нуклеотида (+Т) вэкзоне 10 (позиция 3151) на расстоянии 490 нп «ниже по течению» от мутацииchl1. Также как и в случае chl1, эта инсерция приводит к сдвигу рамкисчитывания и появлению стоп-кодона после 164 триплетов нуклеотидов. Врезультате – синтез короткого нестабильного пептида размером 721 ак.Помимо двух мутаций типа «сдвиг рамки считывания», приведших кблокированию синтеза целого белка CHLH большой субъединицы магнийхелатазы C.
reinhardtii, были обнаружены 7 случаев полиморфизма в экзонах; 10,11 и 12 при сравнении сиквенсов кДНК и геномной ДНК гена CHLH. В пятислучаях замены нуклеотидов не приводили к изменению аминокислотногосостава белкового продукта гена, а в двух случаях они обусловливали появлениеновых аминокислотных остатков в молекуле белка. Так, замена Т-С, в позиции1050 кДНК ведет к замене лейцина на пролин, а замена G-C в позиции 1226приводит к замене серин-треонин. Поскольку штамм дикого типа 137С+, которыйбыл использован для создания кДНК-библиотеки и штамм СС124, на основекоторого был получен мутант chl1, демонстрируют нормальный биосинтез ХЛ,мы пришли к выводу, что эти замены аминокислот не являются значимыми дляфункционирования CHLH белка.
Аминокислотные последовательности продуктовмутантных аллелей гена CHLH: chl1 и brs-1, также как и белка CHLH дикого типапредставлены на рисунке 3.14.184Рисунок 3.14. Аминокислотные последовательности белка CHLH из штаммадикого типа и мутантов по гену CHLH: chl1 и brs-11853.2.3. Вестерн-блот анализ белков магний-хелатазы C. reinhardtiiПервоначально, для иммунодетекции белковых субъединиц магний-хелатазыC. reinhardtii применяли неспецифические антитела, узнающие белки H и Iсубъединицы табака и арабидопсиса (см.
подраздел 3.1.3). Позднее, послеамплификации кДНК фрагментов гена CHLH C. reinhardtii, были полученыспецифические антитела, которые появились в нашем распоряжении к осени 2000года. Эти антитела были использованы для Вестерн-блот анализа, результатыкоторого (рисунок 3.15) подтвердили более ранние данные об отсутствии CHLH вбелковых экстрактах мутантов: chl1 и brs-1 C. reinhardtii, позволив получитьболее ―чистую‖ картинку.Рисунок 3.15.
Вестерн-блот анализ белков, выделенных из клеток штаммадикого типа и мутантов chl1 и brs-1 C. reinhardtii, выращенных в темноте.А. 10 g белка фракционированы электрофорезом в полиакриламидном геле.Иммунодетекцию проводили с поликлональными антителами для рекомбинантногобелка малой субъединицы МХ CHLI табака (Nicotiana tabacum), которые такжереагируют с белками средней субъединицы CHLD.В. Белки экстрагированы из клеток штамма дикого типа и мутантов chl1 и brs-1,выращенных в темноте, после 2-х часов освещения.
Вестерн-блот анализ этихбелков проводили с поликлональными антителами для белка CHLH субъединицы Hмагний-хелатазы хламидомонады, полученные в ходе работы1863.2.4. Геномная комплементация мутантного фенотипаДля подтверждения данных о генетической природе мутаций chl1 и brs-1, какмутаций в гене CHLH, нарушающих синтез большой H субьединицы магнийхелатазы у C. reinhardtii, были предприняты эксперименты по комплементациимутантного фенотипа.
Мутантные штаммы: 1482-2е и brs-1 трансформировалигеномной ДНК, содержащей аллель дикого типа гена CHLH, и вели поисктрансформантов,способныхсинтезироватьХЛнасвету.Также,былаосуществлена ко-трансформация, когда геномную ДНК трансформировалисовместно с плазмидой, содержащей ген устойчивости к паромомицину aphYIII, иселектировали устойчивые к паромомицину клоны в темноте. Посколькумутантные штаммы не ревертируют спонтанно, все зеленые клоны, появившиесяв результате такой трансформиции, мы считали результатом комплементации.―Зеленые‖ трансформанты были получены при трансформации обоих мутантов(chl1 и brs-1), и по содержаниюХЛ они не отличалось от штаммов дикого типа. Вслучае ко-трансформации, 2% паромомицин-устойчивых трансформантов былизелеными в темноте (то есть имели восстановленный синтез ХЛ).
Результаты этихэкспериментов свидетельствовали, что геномный фрагмент, содержащий генCHLH комплементировал обе рецессивные мутации: chl1 и brs-1, доказывая темсамым, что исследуемые мутации затрагивают именно ген CHLH.3.2.5. Экспрессия гена CHLH C. reinhardtii. Регуляция светомЭкспрессию гена CHLH изучали, анализируя содержание его мРНК вклетках штаммов дикого типа и мутантов, выращенных в темноте, и в условияхпереноса культур из темноты на свет методом Нозерн-блот анализа (рисунок3.16).
В клетках темновых культур дикого типа уровень экспрессии гена CHLHочень низок, и он значительно увеличивается при постоянном освещении.Перенесение растущих в темноте культур на свет ведет к увеличению уровнятранскриптов гена уже после двух часов освещения, который достигает187максимума (увеличения более чем в 10 раз) после 4-х часов освещения.Матричная РНК гена CHLH накапливается и в обоих мутантных штаммах:СС1482-2е (генотипа chl1) и brs-1 (рисунок 3.16).
Как и в случае клеток дикоготипа, свет стимулирует ее накопление, свидетельствуя, что мутации типаfraimshift (сдвига рамки считывания) не влияют на транскрипцию гена CHLH, ˗ нина еѐ регуляцию светом, ни на стабильность самих транскриптов.Рисунок 3.16. Транскрипция гена CHLH. 10 g суммарной РНК из клеток штаммадикого типа и мутантов chl1 и brs-1 в фазе экспоненциального роста использовалидля Нозерн-блот гибридизации с фрагментами кДНК гена CHLH C.
reinhardtii.Уровень синтеза мРНК гена CHLH определяли в клетках, выращенных на свету (C), втемноте (Т), и после перенесения на свет в течение 1, 2, 3, и 4-х часов темновыхкультур. В качестве контроля, мембраны гибридизовали с радиоактивными пробамиядерного гена RBCS2 малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазыЭкспрессию гена CHLH исследовали и на уровне трансляции. В клеткахдикого типа (рисунок 3.17), перенесенных из темноты на свет, содержание белкаCHLH увеличивается уже после 2-х часов освещения, и к 6-ти часам достигаетмаксимума, более чем в 9 раз превосходящего минимальный уровень.188Рисунок 3.17.
Экспрессия гена CHLH на уровне трансляции. Вестерн-блотанализ белков с использованием поликлональных антител, полученных к белкуCHLH C. reinhardtii. Каждая линия содержит 20 g белков, выделенных изклеток штамма дикого типа СС124 C. reinhardtii, выращенных в темноте (Т) ипосле их переноса на светВ целом, характер накопления белков CHLH в клетках C. reinhardtiiотражает динамику накопления транскриптов гена CHLH, свидетельствуя, чтосвет регулирует его экспрессию на уровне транскрипции. Ранее мы показали, чтов клетках хламидомонады, выращенных на свету, по сравнению с темновымикультурами повышены активность МХ (на 60%) и суммарное содержаниехлорофиллов (на 35-40%). По-видимому, индукция светом активности МХсвязана с увеличением количества молекул этого фермента, появившихся врезультате активации синтеза их мРНК. Таким образом, результаты изученияэкспрессии гена CHLH в клетках C. reinhardtii свидетельствуют, что светявляется фактором позитивной регуляции транскрипции этого гена, а мутацииchl1 и brs-1 не оказывают заметного влияния на эту регуляцию.3.2.6.
Структурно-функциональные характеристики гена CHLH3.2.6.1. Компьютерный анализ последовательности гена CHLHСтруктурно-функциональные особенности гена изучали, используя ресурсыбазданныхгенетическойинформацииикомпьютерныепрограммысравнительного анализа структуры и функций молекул ДНК, РНК и белков,доступные в интернете (NCBI, ExPASy-tool). Матричная РНК нормального генаCHLH C. reinhardtii (номер регистрации AJ-307054) представляет собой молекулудлиной 5049 нуклеотидов c коротким 5‘ нетранслируемым сиквенсом (25 пн) на1895‘ конце и длинным – на 3‘ конце (828 пн). Эта мРНК имеет на своем 3‘ концесигнал полиаденилирования TGTAA, типичный для генов C.
reinhardtii,кодирующих белки, и короткий поли-А хвост. Стартовый кодон АTG окруженнуклеотидами: AGAAATGCAG, типичными для участков начала транскрипциихламидомонады: (A/C)A(A/C)(A/C)ATG(G/C)C(G/C) (Silflow, 1998). ОРС генакодирует белок протяженностью 1399 аминокислот. Анализ этого белка сиспользованием программных ресурсов молекулярно-биологических серверов(NCBI, MBI, ExPazy-tool, и других) показал, что большая субъединица магнийхелатазы C. reinhardtii ˗ белок с молекулярной массой 154,29 kDа, индексомгидрофобности –0,267 и алифатическим индексом87,12. Аминокислотныйсиквенс не содержит гидрофобных районов, предполагая, что это растворимыйили слабо связанный с мембранами белок.3.2.6.2.
Сравнительный анализ белка CHLH C. reinhardtiiПри сравнительном анализе (BLAST, CLUSTALW) аминокислотного составабелка CHLH C. reinhardtii (рис. 3.18) была установлена высокая степень егогомологии с субъединицами H из других биологических объектов. Такиепоследовательности, обнаруженные в молекулярно-биологических базах данныхпрограммой BLUST2, принадлежат представителям как прокариот: Archae (8) иBacteria (80), в числе которых представители фил: Cyanobacteria – 23 иProteobacteria–19,такиэукариот.Идентичностьаминокислотнойпоследовательности CHLH C.
reinhardtii варьирует от 37% (для белка Rhodobactercapsulatus) до 65% (для его гомологов у львиного зева Antirrinum majus,арабидопсиса Arabidopsis thaliana, и сои Glycine max).БелокCHLH C. reinhardtiiимеет самыйдлинныйиз известныхортологичных ему белков N- концевой сиквенс, который на 15 ак превышаетаналогичные последовательности, кодируемые генами эукариот и на 62аминокислоты длиннее продуктов генов прокариот (Synechocystis PCC6803,Rodobactersphaeroides).ЭтаN-концеваяпоследовательностьсодержит190хлоропластный транзитный пептид. Предполагаемый (по результатам программыChloroP) сайт протеолитического отщепления, которое удаляет транзитныйпептид длиной 36 ак, лежит между аминокислотными остатками V (валина) и A(аланина).Функции субъединицы H МХ предполагают наличие сайтов связывания сионами магния и с молекулами протопорфирина IX, и консервативные районы вмолекуле белка могут быть существенны для реализации этих функций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
