Диссертация (1144823), страница 47
Текст из файла (страница 47)
зел. секторные∑кор./ор.кор./зел.ор./зел.Исключительные(999(%)зиготы(%)мость (%)НомерскрещиванияВыживае-Таблица 3.39. Семейный анализ потомства зигот от скрещиванийкоричневых мутантов на штаммы дикого типа и мутанты по генуCHLH1151003914550,468520380100085680,56846300180073213,9Из потомства исключительной зиготы - тетрады 1712-1, в которойнаблюдали расщепление по окраске колоний: 2 кор. : 2 зел., были отобраныдля дальнейших исследований зеленые клоны: 1712-1б и 1712-1в, которые,всоответствиисправиламиоднородительскогонаследованияхлоропластных маркеров, должны нести мутацию mod-u-25 на фоне аллелидикого типа гена CHLH.2643.5.3.
Влияние мутации mod-u-25 на синтез АЛКПриступаякизучениюрегуляторныхкоричневыхмутантовхламидомонады, мы, прежде всего, предполагали выяснить, влияет лимутация mod-u-25, приводящая к усиленному накоплению ПП клеткамимутанта chl1 хламидомонады, на синтез АЛК. Относительную активностьферментов, синтезирующих АЛК, у мутантов и штамма дикого типаопределяли, измеряя количества АЛК, которые клетки накапливают приобработкеихсублетальнымидозамилевулинатакальция(ЛК)–конкурентного ингибитора АЛК-дегидратазы, по известной методике[Milleret. al., 1979], предварительно адаптировав еѐ для хламидомонады. Дляподбора сублетальных для C.
reinhardtii доз ЛК, мы оценили егоингибирующее действие (таблица 3.40) на штаммы хламидомонады вусловиях гетеротрофного роста, и установили, что для одиночных мутантовгенотипа: chl1 и lts3 по генам CHLH и LTS3, соответственно, а такжештамма дикого типа, сублетальный эффект достигается при концентрацииТаблица 3.40. Влияние левулината кальция (ЛК) на штаммыхламидомонадыШифр штамма(тип спаривания)Генотип137С(+)1482-2е (+)1515-19в (-)Н-19 (-)*Н-19-25 (-)1481-1в1486-18вBrs-1 (+)Brc-1 (+)wtchl1-19or2/5chl1-19chl1-19*lts3lts3,ery3brs-1brc-1Рост клеток на среде ТАР с ЛК в концентрации(mМ):00,1124810+++++/++++++++++/+++++/+++++/+/+/+++++/+++++/++-*Примечания: (+) – означает наличие роста, (-) – его отсутствие; (+/-) – слабоеингибирование; wt. – дикий тип; * - штамм несет ещѐ мутацию mod-u-25265ЛКравной4mМ.Мутантыbrs-1иbrc-1оказалисьнаиболеечувствительными к ЛК и гибнут при его концентрации в 0,1 mМ.ИзмеренияотносительнойактивностиАЛК-синтезирующихферментов (таблица 3.41) показали, что в клетках коричневых штаммов свысоким уровнем накопления ПП примерно вдвое (по сравнению содиночным мутантом chl1 и штаммом дикого типа) увеличено содержаниеАЛК.
Мутантная аллель mod-u-25 на фоне мутации lts3 по гену LTS3 и вотсутствии других мутаций также ведет к усилению синтеза АЛК. Такимобразом, эффект мутации mod-u-25 состоит в усилении активностикомплекса ферментов, синтезирующих АЛК.Таблица 3.41. Относительная активность АЛК-синтезирующихферментов и накопление хлорофилла (ХЛ) и протопорфирина IX (ПП) уанализируемых штаммов хламидомонадыГенотипФенотипwt (свет)wtchl1chl1,mod-u-25chl1,mod-u-25mod-u-25lts3lts3,mod-u-25зеленаязеленая.оранжеваякоричневаякоричневаязеленаяоранжеваякоричневаяНакопление ХЛ и его предшественников:АЛКППХлорофилл79(nM/10 кл)(μM/10 кл)(μM/109 кл)3,01±0,041н.о.4,12±0,0462,14±0,041н. о.3,46±0,0022,58±0,0540,182±0,00370,0015,33±0,0584,593±0,03210,0075,18±0,0124,314±0,00420,0053,10±0,035н.о.3,516±0,0081,70±0.0140,049±0,0020,0153,36±0.0271,337±0,0160,017Примечания: относительная АЛК-синтетазная активность определяетсяколичеством АЛК, которое клетки накапливают при обработке сублетальнымидозами ЛК (4mМ); обозначения: зел.
– зеленая, ор. – оранжевая, кор. – коричневаяокраска колоний; н. о. – не обнаружено.Метаболическаярастенийирегуляциязеленыхпротохлорофиллидомбиосинтезаводорослей(ПХЛД)путемхлорофиллаосуществляетсяобратногоувысшихгемомингибированияиили266репрессии АЛК – первого общего специфического интермедиата биосинтезапорфиринов [Tanaka, 2007]. Клетки мутантов по гену CHLH не содержатПХЛД. Рассматривая другие возможности изменения регуляции, мыпредположили, что мутация mod-u-25 либо снижает чувствительность АЛКсинтетазной системы клетки к другому его ингибитору – гему, ослабляярегуляторное воздействие последнего, либо блокирует синтез гема измолекулыПП,уменьшая,темсамым,уровеньсодержанияэтогоингибитора. Для проверки первого предположения определяли зависимостьотносительнойактивностиАЛК-синтезирующихферментныхсистеманализируемых клеток от дозы ингибитора, оценивая, тем самым, ихчувствительность к гему.
На рисунке 3.40 видно, что экзогенный гем вконцентрации 5 μМ вызывает снижение примерно на 50% АЛК-синтетазнойактивности клеток всех анализируемых штаммов. По-видимому, синтезАЛК у двух проверенных мутантов генотипа: chl1 и chl1,mod-u-25, такжекак и у штамма дикого типа, одинаково чувствителен к подавлению гемом.Следовательно, действие мутации mod-u-25 не связано с понижениемчувствительностиАЛК-синтезирующихферментоввклеткаххламидомонады, мутантных по гену CHLH, к ингибированию гемом.Причиной ослабления ингибирующего действия гема на комплексферментов, синтезирующих АЛК, может быть и уменьшение его количествав клетке. Гем (протогем) синтезируется непосредственно из ПП ферментомгем-синтетазой (Fe-хелатазой), который осуществляет включение железа вмолекулу ПП.
Измерение накопления протогема у штамма дикого типа ианализируемых мутантов показало (таблица 3.42), что относительноесодержание гема в клетках дикого типа и двух одиночных мутантоводинаково. Это означает, что мутация mod–u-25 не влияет на активностьферментныхсистем,контролирующихуровеньгемавклеткаххламидомонады. У двойного мутанта уровень свободного протогемаувеличен вдвое, как и уровень накопления АЛК (таблица 3.42).267Рисунок 3.40. Зависимость активности АЛК-синтезирующих ферментов отконцентрации гема. Клетки мутантов и дикого типа обрабатывали гемином(Sigma), вводя его экзогенно в культуральную среду в виде 2,5 µM раствора всмеси: 0,05М КОН- 96% этанол (1 : 1 по объему) [Hoober et.
al., 1981], иизмеряли содержание в них АЛК после 24 часов культивирования в темнотеТаблица 3.42. Содержание протогема в клетках мутантов C. reinhardtiiГенотипФенотипwtchl1chl1,mod-u-25mod-u-25зеленаяоранжеваякоричневаязеленаяГем(nM/109 кл)12,625±2,26511,215±0,22525,345±2,11511,038±1,2563.5.4. Фенотипический эффект мутации mod-u-25В поисках самостоятельного фенотипического проявления мутацииmod-u-25, которая приводит к усилению синтеза АЛК, мы исходили изпредположения, что мутанты хламидомонады, имеющие повышенную АЛКсинтетазную активность, должны обладать и повышенной устойчивостью к268левулиновой кислоте (ЛК).
Проверка изучаемых штаммов хламидомонадына устойчивость к этому конкурентному ингибитору АЛК показала, чтомутация mod-u-25 обусловливает устойчивость к 10 mM ЛК, губительнойдля клеток дикого типа и одиночных мутантов по генам CHLH и LTS3(таблица 3.43). Коричневые двойные мутанты (chl1,mod-u-25), сегрегантзеленого диплоида 1525-1а, имеющий гибридный хлоропласт (mod-u-25/+),и зеленые гаплоиды: 1712-1б и 1712-1в (генотипа: mod-u-25)– всеоказались устойчивы к ЛК в концентрации 10 mM.Таблица 3.43. Устойчивость к левулинату (ЛК) штаммов, несущихмутацию mod-u-25Шифрштамма(mt)Фенотип137С(+)1482-2е (+)1515-19в (-)*Н-19-25 (-)1528-2 (+)1712-1а (+)1712-1б (-)1712-1в (+)1525 -1а (-)зеленыйоранжевыйоранжевыйкоричневыйкоричневыйкоричневыйзеленыйзеленыйзеленыйГенотипwtchl1chl1chl1,mod-u-25chl1,mod-u-25chl1,mod-u-25mod-u-25mod-u-25chl1/+,mod-u-25/+Рост культур на среде с ЛК(mM)1mM+++++++++4mM10mM15mM+/++/+/+/+/+/+/+/-+/+/+/+/+/+/--Наследование признака устойчивости к 10 mM ЛК изучали методомгибридологического анализа.
Потомство зигот скрещиваний зеленых,устойчивых к ЛК штаммов: 1712-1б и 1712-1в (генотипа: mod-u-25) наштаммы дикого типа (таблица 3.44) было проверено на устойчивость клевулинату кальция (ЛК+), и выяснилось, что этот признак наследуется пооднородительской схеме– от родителя mt(+) как хлоропластныйдетерминант. Результаты гибридологического анализа свидетельствуют, чтоmod-u-25–мутантная аллель хлоропластного гена. Эта мутация приводит к269усилению синтеза АЛК - первого общего интермедиата биосинтеза ХЛ игема, и может быть тестирована по устойчивости клеток к 10 mM ЛК.Таблица 3.44. Тетрадный анализ потомства скрещиваний устойчивых клевулинату (ЛК) мутантов (mod-u-25) на штаммы дикого типаНомерскрещиваниягенотипродителейmt(+)mt(-)Число полных тетрад срасщеплением:4ЛК2ЛК+ : 24ЛК+∑ЛК1715wtmod-u-25910101717mod-u-25wt052025клоны, устойчивы к ЛК ˗ ЛК+; чувствительные к ЛК ˗ ЛК- .Передачапризнакаот mt(+)10%80%3.5.5.
Влияние mod-u-25 на экспрессию генов HSP70A и CabIIНа модели изучения индуцированной светом экспрессии гена CABI(другое название – LHCBP) белка светособирающего хлорофилл а/bкомплекса хлоропласта, установлено, что в норме, при деструкциихлоропласта экспрессия ядерных генов, кодирующих белки хлоропласта,подавляется [Mayfield and Taylor, 1984].
У хорошо изученных регуляторныхмутантоварабидопсиса,названыхgun(1-5)(genomesuncoupled),транскрипция этих ядерных генов сохраняется (в отличие от нормальныхрастений) в условиях фотодеструкции хлоропластов – при освещениипроростков, обработанных норфлюразоном (НФ) - ингибитором биосинтезакаротиноидов [Larkin and Ruckle, 2008]. Тетрапирролы: гем и магнийпротопорфирин IX рассматриваются в качестве сигнальных молекулхлоропласта, влияющих на экспрессию генов ядра. Довольно подробноизучено влияние света и порфиринов на экспрессию ядерного гена HSP70Абелка теплового шока – одного из 9 белков хламидомонады, подобныхHSP70 [Müller et al., 1992].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
