Диссертация (1144823), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Бояджиев использовал для мутагенеза N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин(МННГ) и УФ-излучение [Бояджиев, 1974]. Среди 169 отобранных им мутантовбыло обнаружено несколько ―оранжевых‖ штаммов, у которых признак―оранжевости‖ наследовался моногенно. На основе результатов спектро- имикроспектрофотометрии клеток этих мутантов предположили, что красныйпигмент в их клетках может быть предшественником хлорофиллов (ХЛ) протопорфирином IX (ПП). Обрабатывая клетки зеленых диплоидов МННГ,Eлена Чумакова также получала оранжевые формы [Чумакова, 1976].
Оранжевыемутанты С. reinhardtii были изолированы и в США [Wang et al., 1974, 1978].Исследователиописалидванеаллельных,накапливающихвтемнотепротопорфирин IX мутанта: brs-1 и brc-1. Фенотипические различия между нимибыли заметны в условиях освещения – клетки мутанта brs-1 погибали, а культурыштамма brc-1 зеленели, накапливая ХЛ. Мутации brs-1 и brc-1 оказалисьядерными, рецессивными, наследовались моногенно и не демонстрировалигенетическогосцепления.Объясняяфенотипэтихмутантов,авторыпредположили, что превращение ПП в Mg-ПП осуществляется отдельно на светуи в темноте.
Локус brs кодирует фактор, существенный для обеих – темновой исветовой реакций, а мутация brc-1 блокирует светонезависимую (темновую)реакцию [Wang et al., 1974, 1978]. К началу 80-х годов в лаборатории былнакопленобширныйгенетическийматериал, ивозникланеобходимость135системных исследований групп фенотипически сходных мутантов. Предметомнастоящегоисследования(таблицы:3.1,3.2)сталибесхлорофильные,накапливающие красный пигмент (предположительно протопорфирин), мутантыC. reinhardtii из Петергофской Генетической Коллекции и из коллекции ЦентраГенетики Хламидомонады (CGC, Chlamydomonas Genetic Center). Описаниерекомбинантов,гаплоидныхидиплоидныхштаммов,полученныхииспользованных в работе, будут даны в ходе изложения экспериментальногоматериала.Таблица 3.1.
Гаплоидные мутанты C. reinhardtii, использованные в работеМутантУсловия получения*ГенотипСсылкаN-19НЭМmt-, chl1Cтолбова, 1971N-122НЭМmt-, lts3Столбова, 1971НГ-2НГmt-, lts7Бояджиев, 1974sr-2-60/13НГmt-, or13Бояджиев, 1974494/3НГmt-, or3Бояджиев, 1974494/69МННГmt-, or69Бояджиев, 1974Brs-1УФmt+, brs-1Wang et al., 1974Brc-1УФmt+, brc-1Wang et al., 1974 * -- мутации индуцированы: НЭМ – нитрозоэтилмочевиной; МННГ - N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином; УФ - ультрафиолетовым излучением.3.1.1.2.
Спектрофотометрия мутантовДля всех штаммов из группы изучаемых мутантов характерно отсутствие ХЛ испособность клеток в условиях гетеротрофного роста накапливать бурый пигментпорфириновой природы,который придаетжелто-оранжевую окраску ихколониям. На этом основании мутанты были объединены общим названием –хлорофильные оранжевые мутанты (ХОМ).136Фенотипическое описание ХОМ начали с получения их спектральныххарактеристик. Спектры поглощения нативных культур (рисунок 3.1А, Б)демонстрировали, что для всех изучаемых мутантов характерно уменьшениепоглощения в специфических для ХЛ полосах: 650 нм и 670-680 нм.
Поглощениев области 540 нм характерно для протопорфиринов (Wettstein, 1971). В синейобласти (490 нм) поглощают каротиноиды, но они имеются в клетках всехАБРисунок 3.1. Спектры поглощения суспензий гетеротрофно-выращенныхкультур дикого типа (wt) и хлорофильных оранжевых мутантов C. reinhardtii137штаммов, и не служат отличительными признаками. По содержанию ХЛнаблюдаются межштаммовые различия. Для клеток генотипа: chl1-19, or2/5 и or3характерно полное отсутствие хлорофиллов, тогда как формы с мутациями or13 иlts3-122 содержат некоторое его количество.3.1.2. Гибридологический анализ хлорофильных оранжевых мутантов3.1.2.1. Оптимизация условий проведения скрещиванийГибридологический анализ хлорофильных оранжевых мутантов (ХОМ) долгоевремя был затруднен из-за крайне низкой фертильности мутантных клеток[Бояджиев,1974].Егоосуществлениесталовозможнымтолькопослепредварительной работы, направленной на повышение их фертильности.
Этазадача была решена с применением нескольких подходов:а) выяснением оптимальных условий культивирования ХОМ;б) получением фертильных рекомбинантов исходных мутантных штаммов;б) получением диплоидных форм для проведения анализа на полиплоидномуровне.Оптимальной средой для выращивания культур ХОМ оказалась среда TAP свысоким содержанием буферных растворов и ионов магния. Добавление в средутиамина (1 мг/л), благоприятно влияло на состояние культур, поскольку их клеткичувствительны к антиметаболиту тиамина – окситиамину.Проведение тетрадного анализа возможно только при наличии фертильных(обладающих высокой жизнеспособностью мейотического потомства) гибридовзигот (Инге-Вечтомов, 1971).
У С.reinhardtii использование рекомбинантов,прошедшихнесколькотуровскрещиваний,увеличиваетвыживаемостьмейотических спор, повышая эффективность гибридологического анализа[Александрова и др., 1979]. Коллекцию фертильных рекомбинантов получали,проводя исходные мутанты через серии внутритетрадных и возвратныхскрещиваний(таблица3.3).Типичнаясхемаполученияфертильного138рекомбинанта представлена на рисунке 3.2. Так, штамм H-19 из ПГК помимомутантной аллели chl1-19, несет модификаторную мутацию, усиливающуюнакопление пигмента порфириновой природы.Рисунок 3.2. Получение фертильного штамма 1482-2е –рекомбинанта штамма Н-19 из ПГКВ потомстве скрещиваний с участием Н-19 и его рекомбинантов последовательноотбиралимейотическиесегрегантымутантногофенотипапопризнакамповышенной фертильности и гомогенной окраски.
Гибридологический анализзигот от скрещивания оранжевых мутантов между собой подтвердил отсутствиемодификатора в их генотипах, и в ходе дополнительных туров скрещиваний былполучен фертильный сегрегант 1482-2е, генотипа:chl1-19.У С. reinhardtii вероятность образования зигот повышается при увеличенииплоидностиродительскихформ,участвующихвскрещивании,ажизнеспособность зооспор в мейотическом потомстве тетраплоидных зиготмноговыше,чемдиплоидных(Чемерилова,1979).Дляповышения139эффективности гибридологического анализа получали оранжевые диплоиды,используя имеющиеся в ПГК гетерозиготные по мутациям ―оранжевости‖ формы(таблица 3.2).
Плоидность исходных и полученных в работе штаммов определялипо нескольким критериям: средний объем клеток, суммарное количество ДНК наклетку, и характер расщепления в потомстве гибридов.Таблица 3.2. Штаммы, использованные для получения полиплоидных формШтаммФенотипГенотипПроисхождение11-32fArg7Д-2Т-5-52гД-13/1sr10Д19/2-20зеленый, аргининзависимыйзеленый, аргининзависимыйзеленый, прототрофзеленый, аргининзависимыйзеленый, прототрофmt+,arg7mt-,arg7-8mt+/-,arg7/arg7-8mt+/-,arg7-8/arg7-8, or2/5/+mt+/-, or13/+CGCCGCПолучен в работеЧумакова, 1979Чумакова, 1979зеленый, прототрофmt+/-, arg7-8/+, chl1/+Чумакова, 1979Так, диплоид Д-19-14 был отобран из потомства скрещивания двух диплоидов:гетерозиготного по мутации chl1-19 штамма Д-19/2-20и штамма Т-5-52г.Последний был описан как рекомбинант из тетраплоидного расщепления(Чумакова, 1976).
В семейном анализе зигот от скрещивания Т-5-52г и зеленогодиплоида Д-2, гетерозиготного по комплементирующим аллелям гена Arg7(arg7/arg7-8), среди 1760 проанализированных зеленых колоний было отобранодва оранжевых клона: Д-2/5-16 и Д-2/5-18, которые по критерию среднего объемаклеток (99 мкм3) были отнесены к гаплоидам. Вероятно, спонтанно возникшаямутация, названная or2/5, рецессивна и локализована рядом с центромерой.Итогом работы по повышению эффективности гибридологического анализастала коллекция фертильных штаммов (таблица 3.3), включающая гаплоидныерекомбинанты исходных мутантов, где каждый генотип представлен формамиобоих типов спаривания, и диплоид Д-19-14.
Штамм со спонтанно возникшеймутацией or2/5 также пополнил коллекцию оранжевых гаплоидов. Проверка140характера наследования изучаемых мутаций (таблица 3.4) показала, что онинаследуются моногенно (2+ : 2-) без реципроктных различий, и, следовательно,локализованы в ядерном геноме хламидомонады.3.1.2.2. Анализ комплементации мутаций у ХОМ C. reinhardtiiГенетическиеисследованияфенотипически-сходныхмутантовпредполагают выявление их аллельных взаимоотношений.
Аллельность в группехлорофильных оранжевых мутантов изучали, используя два традиционных теста:комплементационный и рекомбинационный.В жизненном цикле C. reinhardtii диплоидная стадия представленапокоящейся зиготой, которая в благоприятных условиях претерпевает мейоз.Часть зигот (1-5%) не приступает к мейотической редукции, и дает началоколониям вегетативно размножающихся диплоидов [Harris, 1989]. Методполучения вегетативных диплоидов состоит в скрещивании двух ауксотрофныхмутантов и отборе на селективной минимальной среде диплоидных клонов,способных к прототрофному росту [Ebersold, 1967].
Диплоиды характеризуютсяувеличенным вдвое объемом клеток и изменением характера расщепления прискрещивании их с гаплоидами [Ebersold, 1967]. После обнаружения межаллельнойкомплементации в гене Arg7 [Loppes et al., 1972], для получения диплоидов сталииспользовать ауксотрофы, мутантные по комплементирующим аллелям arg7 иarg7-8 этого гена:, что практически предотвращало появление гаплоидныхпрототрофных рекомбинантов.Вышеописанныйметодполучениявегетативных диплоидов предусматривает предварительное конструированиедвойныхмутантов,сочетающиханализируемыемутацииимутацииаргининзависимости.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
