Диссертация (1144820), страница 44
Текст из файла (страница 44)
В четвертую группу (красный цвет) вошли гены TPD52,ENPP1, PCSK1, POMC, NPY. Центральный ген данной группы –проопиомеланокортин (POMC), взаимодействовал с ожирением напрямую, сгипертензией - через ген NPY, а с инсулинрезистентностью - через геныTPD52, ENPP1, PCSK1.На основании проведенного анализа сложно выделить специфичныефакторы риска изученных патологий, однако можно предполагать, что естьобщие механизмы развития данных заболеваний, и их вероятнымиучастниками являются гены ADRB3, ADIPOQ, ADRB2, LPL, GH1, TNFA,POMC.3.2.2.2.2. Исследование алелельных вариантов генов CDH13 (rs11646213A/T), MTHFR (rs17367504 A/G), CDKN2/BAS (rs4977574 A/G), а такжемаркера (rs11191548 T/C) в качестве кандидатов риска развития гипертонии.Для комплексного изучения новых маркеров заболеваний путемверификации GWAS-данных, полученных в результате мультицентровыхисследований,наотечественнойисследованиевариантовгеноввыборкебольныхСDH13,MTHFR,былопроведеноCDKN2/BASиCNNM2/NT5C2 у детей с повышенным уровнем артериального давления идетей контрольной группы (Kanaeva et al., 2014).Были установлены частоты комбинации аллелей и аллелей по генамСDH13, MTHFR, CDKN2BAS и rs11191548 T/C в группах детей с301302артериальной гипертензией и в контрольной группе детей (см.
табл. 72),распределение которых во всех случаях соответствовало закону ХардиВайнберга (2<3.84, р>0.05).Cравнительный анализ частот комбинации аллелей и аллелей для геновСDH13, MTHFR, CDKN2/BAS и rs11191548 T/C между группой детей с АГ иконтрольной группой не выявил статистически значимых различий (p>0,32)(Kanaeva et al., 2014). Таким образом, достоверной ассоциации между ранеенайденными методом GWAS маркерами и риском развития АГ у детей,проживающих в Санкт-Петербурге, обнаружено не было.Таблица 72.
Сравнительный анализ частот комбинаций аллелей удетей с АГ и в контроле по генам – кандидатам, ранее выявленных методомGWAS (по Kanaeva et al., 2014).Ген/полиморфныймаркерЧастоты комбинаций аллелей(%)CDH13 rs11626413A/AA/TT/TДети с АГ (n=115)18,840,640,6Контрольная группадетей (K) (n=100)14,049,037,0MTHFR rs17367504A/AA/GG/GДети с АГ (n=115)89,88,22,0К (n=100)86,011,03,0CDKN2BAS1 rs4977574A/AA/GG/GДети с АГ (n=115)27,047,825,2К (n=103)29,753,516,8rs11191548T/TT/CC/CДети с АГ (n=115)85,214,80К (n=103)90,29,80Значение p0,430,710,320,373023033.2.2.3. Заключение.В результате проведенного исследования изучены известные и новыемаркеры АГ и МСО.
Для установления связи с патогенезом АГ и МС, так же,как и в случае с гестозом, были применены различные стратегии: от«традиционного» исследования частот аллелей и комбинации аллелей досоздания математических моделей предсказания риска заболевания. Спомощью классических подходов было установлено, что определенныеаллели генов AGTR1 (1166A>C) и AGTR2 (3123C>A) ассоциированы с рискомразвития АГ. В то же время у мальчиков, но не у девочек, некоторыемаркеры генов APOE (E2, E3, E4), NOS3 (-786T>C) обладают протективнымдействием к АГ.
Установлено также, что полиморфизм генов AGTR2(3123C>A) и LPL (S447X) определяет риск развития МСО у девочек.Корреляционный клинико-генетический анализ подтвердил участие геновREN, AGT, AGTR1, BKR1, NOS3 в патогенезе АГ, но не МС.Математические модели АГ, построенные на основе метода MDR иметода GLM, включали ранее упомянутые гены-кандидаты: AGTR1, AGTR2,MTHFR, NOS3, AGT, REN, ACE. Математические модели МСО такжевключали гены LPL, APOE, BR1 (BDKRB2), AGT. Однако модели МСО (вотличие от таковых при АГ) были построены только на основании методаMDR.Подводя итог моделям АГ и МСО, а также установленнымстатистическим закономерностям, необходимо отметить, что использованиекак «классического» расчета риска, так и оценку риска заболевания наоснованииматематическогомоделированияследуетпроводитьисключительно для формирования групп риска, но не его индивидуальногопрогноза.Не могут быть использованы для точного прогноза риска АГ имногообещающие GWAS-маркеры (см.
п. 1.5.2.5). В результате настоящейработы не было выявлено достоверной ассоциации между вариантами генов303304CDH13 (rs11646213 A/T), MTHFR (rs17367504 A/G), CDKN2BAS (rs4977574A/G) и rs11191548 T/C и АГ в нашей выборке пациентов.Необходимо отметить, что помимо известных генов-кандидатов АГ иМС, впервые были изучены и некоторые новые маркеры риска этихзаболеваний. В частности, были проведены теоретические исследованиягенных сетей, которые показали, что формирование групп риска АГ и МСможно проводить, используя специфические маркеры этих патологий - FOS,NPY (артериальная гипертензия) и IL10, IL6, TPD52, ENPP1, PCSK1(метаболический синдром и ожирение).Таким образом, в настоящем исследовании была подтвержденаассоциация известных генов кандидатов с риском развития АГ и МСО.Данный факт подтверждает важную роль в патогенезе этих болезней, преждевсего, генов артериального давления и метаболизма липидов.304305ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕРасшифровка генома человека, идентификация всех его генов ивыяснение молекулярных механизмов биологических процессов значительнорасшириливозможностидиагностикиипрофилактикинетольконаследственных, но и МФЗ (Баранов, 2000, 2009).
Именно профилактика,нацеленная на разработку эффективных мер прогнозирования риска развитиятех или иных болезней, в настоящее время становится магистральнымнаправлением современной медицины (Баранов, 2011, 2013, 2014; Puzyrev,Freidin, 2009; Пузырев, 2009, 2015; Пузырев, Кучер, 2011; Кучер, 2015).Анализ геномного полиморфизма уже нашел широкое применение и дляизученияважнейшихфундаментальныхпроблембиологиичеловека,связанных с его онтогенезом, филогенезом, этногенезом и др. (Степанов,2010, Хуснутдинова, 2010; Балановская, Балановский, 2012; Боринская,Янковский, 2013, 2015).Данный раздел диссертации посвящен обсуждению преимуществ иограничений, разработанных нами вариантов генетической диагностики набиочипах, оценке на основании статистических и биоинформатическихподходов вклада различных генетических маркеров в риск развития МФЗ.4.1.
Оценка преимуществ метода гибридизации на биочипах дляизучения генетического полиморфизма человека.4.1.1. Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическимиметодами анализа.На сегодняшний день существует огромное количество разнообразныхметодов анализа генетического полиморфизма (http://www.molbiol.ru). К нимотносятся ПДРФ-анализ, анализ длин амплифицированных фрагментов(ПДАФ), и методы, основанные на лигазной реакции, аллель-специфичнаяПЦР (АС-ПЦР), анализ конформационного полиморфизма одноцепочечныхфрагментов (SSCP), гетеродуплексный анализ, микрочипы, секвенированиеДНК и многие другие.305306Технологиямикрочиповиспользуетсявразличныхобластяхбиомедицины уже более 20 лет.
Данная технология до сих пор сохраняетинновационность не только для молекулярной биологии, но и для ряданаправлений медицинской диагностики (Cook, Rosenzweig, 2002; Gryadunovet al., 2011).Технология микрочипов обладает рядом преимуществ по сравнению склассическими методами анализа. Основные среди них – это низкаясебестоимость(проведениереакциивмикрообъеме),увеличениечувствительности, уменьшение числа параллельных реакций, возможностьувеличенияинформационнойемкостисистемыбезсущественногоусложнения методики (анализ большого числа локусов одновременно),снижение трудоемкости, и возможность автоматизации анализа (Nasedkina etal., 2009). Сравнительные характеристики технологий микрочипов и методовПДРФ и ПЦР в «реальном времени» приведены в таблице 73.Таблица 73.
Сравнительные характеристики технологии биочипов,метода ПЦР/ПДРФ и ПЦР в «реальном времени».ПОКАЗАТЕЛИПЦР/ПДРФПреимуществаСредняяточность.Низкаясебестоимость.ПЦР В«РЕАЛЬНОМВРЕМЕНИ»Высокая точностьичувствительность.Возможностьанализа до шестилокусоводновременно.Длительностьанализа 2 часа.Закрытая системадиагностики.ГИБРИДИЗАЦИЯНА БИОЧИПЕВысокая точность ичувствительность.Низкаясебестоимость.Возможностьточного анализабольшого числалокусоводновременно (до100).306307НедостаткиДлительностьВысокаяанализа: 5-24себестоимость.часов.Отсутствиевозможностианализабольшого числалокусоводновременно.Длительностьанализа 9-18 часов.Несмотря на активное развитие в последние 5-10 лет технологииполногеномного секвенирования, масспектрометрии и других методов,гибридизациянабиочипахнизкойплотностисохраняетбольшиеперспективы, благодаря её низкой стоимости и возможности быстрого,точного и одновременного анализа многих генов и мутаций (Gryadunov et al.,2011; Marasso et al., 2014).Разработанные нами (совместно с Институтом молекулярной биологииим.В.Н.ЭнгельгардтаРАН)биочипыдляанализагенетическогополиморфизма как раз можно отнести к группе «тематических» биочипов сопределенным набором генов и мутаций.
Они заметно сокращают времяанализа по сравнению с методом ПДРФ (табл. 77), снижают его стоимость итрудозатраты (в полтора-два раза по сравнению с ПЦР в реальном времени иПДРФ анализом), позволяют одномоментно анализировать не менее 14-тимутаций.4.1.2. Перспективы использования «Фибр-биочипа».Разработанный нами «Фибр-биочип» предназначен, прежде всего, длярутинной диагностики. Приоритетом «Фибр-биочипа» остается диагностиканаследственной тромбофилии, которая является риском развития рядапатологий, включая гестоз и тромбоз (Kupferminc, 2005; Vlachou et al., 2010).Среди зарубежных аналогов можно выделить такие разработки какэлектронный диагностический чип (Moutereau et al., 2004), трехсенсорнаяпанель для детекции мутаций в генах тромбофилии (Vlachou et al., 2010),307308Verigene®F5/F2/MTHFRтест(Leffertsetal.,2009),HumanCVDсфокусированнй биочип (Gaunt et al., 2013) и другие.
Большинство этихразработок пока не внедрены в практику, тогда как «Фибр-биочипа»(торговая марка «ПФ-биочип» (Тромбо) уже широко используется в клинике.Только в ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О.Отта» с помощью микрочиповойтехнологии в год проводят более 1500 анализов.Сравнение4.1.3.технологийнаосновебиочиповсметодамиполногеномного секвенирования.Большинство современных биочипов являются SNP-микрочипами, спомощью которых можно исследовать более миллиона однонуклеотидныхзамен одновременно.
Такие биочипы дороги, однако их можно использоватьв микроделеционном анализе (Riggs et al., 2014), в исследованиях типаGWAS (Smith et al., 2010; Tang et al., 2013), а также при диагностикенекоторых наследственных заболеваний и МФЗ (Moutereau et al., 2004;Theodoraki et al., 2010).Несмотря на преимущества биочипов «высокой плотности», сегодняони быстро замещаются технологией секвенирования следующего поколения(NGS).NGSявляетсянаиболеевысокопродуктивнойтехнологиейисследования генома (Ong et al., 2013). Однако и она не лишена ряданедостатков, главным из которых является высокая частота так называемых«indel error rate» - ошибок при детекции инсерций и делеций (Robasky et al.,2014).На примере анализа полиморфизма в генах SERPINE1 (PAI1),rs1799762 (5G>4G) и MTHFR (C/T, rs1801133) было проведено сравнениеметода биочипов и NGS секвенирования (Glotov et al., 2016).
Установлено,что обе технологии с высокой точностью определяют генотипы по генуMTHFR (C/T, rs1801133), однако при детекции 5G>4G замены по генуSERPINE1 (вариант «инсерция/делеция») возникают трудности. Определятьданный вариант способен только метод биочипов, тогда как при NGS308309секвенировании он регистрируется исключительно только как 4G/4G. Такаяособенностьобъясняетсяплохойдетекциейтехнологиейполупроводникового секвенирования гомополимеров нуклеотидов (Robaskyet al., 2014). А так как подобных замен немало в геноме человека (Robasky etal.,2014),развитиегенетическойальтернативныхдиагностикиостаетсяNGSоднойсеквенированиюихметодовприоритетныхзадачбиомедицины.Таким образом, ни одна из существующих технологий анализа ДНК неявялется универсальной и ее выбор во многом определяется задачамиисследования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
