Диссертация (1144724), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Тем не менее, ранее не были описаны мутанты бобовых растенийс дефектами по симбиозу, демонстрирующие усиленное отложение каллозы.Экзополисахариды и липополисахариды вовлечены в супрессию защитныхреакций, запускаемых ризобиями (Fraysse et al., 2003).
В этой связиотложение каллозы, наблюдаемое у мутанта по гену Pssym42, можетуказывать на то, что ген PsSym42 вовлечен в восприятие полисахаридоврастением, или является участником активируемого ими сигнальногокаскада. С другой стороны, ген PsSym42 может быть вовлечен в созреваниесимбиосомноймембраны,котороесопровождаетсяизменениемегоэпитопного состава (Brewin, 2004). Возможно, что в клубеньках мутантаPssym42 аномальный эпитопный состав ведет к отложениям каллозы. Данноепредположение выглядит более предпочтительным, поскольку отложениякаллозы в клеточных стенках и стенках инфекционных нитей появляются вовремя созревания инфекционных нитей.В исследование был включен ряд молекулярных маркеров защитногоответа (Die et al., 2010; Reguera et al., 2010), для чего был проведен анализуровня транскрипции трех ключевых генов: — 7RA84 (пероксидаза),HSR203J (маркер реакции гиперчувствительности) и ABR17 (белок PR10).В клубеньках линии дикого типа SGE максимальный уровеньактивности гена 7RA84 наблюдался на 14-й ДПИ, который, вероятно,соответствует максимальному уровню пероксида водорода в тканяхрастения-хозяина.
В развивающихся клубеньках на 14-й ДПИ инфекционныенити растут и ветвятся в зоне инфекции, бактерии высвобождаются вцитоплазму растительной клетки и дифференцируются в симбиосомы.Пероксид водорода участвует в перекрестном сшивании гликопротеиновмежклеточного матрикса, которое, вероятно, необходимо для роста иразвития инфекционной нити (Brewin, 2004). Поэтому, присутствиеневысоких концентраций пероксида водорода является необходимым длянормального развития бобово-ризобиального симбиоза. Тем не менее,Результаты и обсуждение348пероксид водорода является АФК, и высокий уровень его продукции вклеткахможетпроявлениемпривестизащитногококислительномуответарастения.стрессу,Пероксидазаявляющемусявовлеченавлигнификацию клеточной стенки посредством окисления структурныхбелков клеточной стенки, укрепляя их во время поранения или патогеннойатаки (Pérez-de-Luque et al., 2006). Высокая активность гена пероксидазы вклубеньках мутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33) на всех стадиях развития,вероятно, связана с активной суберинизацией центральной части клубенька идругимизащитнымиреакциями,вызываемымивосприятиемсимбиотического партнера в качестве патогена.Нами была отмечена интенсивная аккумуляция пероксида водорода винфекционныхнитях, инфекционныхкапляхивокругювенильныхбактероидов в клубеньках мутантной линии SGEFix−–1 (Pssym40) (Цыгановаet al., 2009) (см.
раздел 3.6). Сильное увеличение уровня экспрессии гена7RA84 в клубеньках мутантной линии SGEFix−–1 (Pssym40) можетобъясняться развитием окислительного стресса, подобно тому, которыйразвивается при несовместимом патогенном взаимодействии (Hancock et al.,2002). Увеличение активности этого гена к 42-му ДПИ, по сравнению с 28-мДПИ, вероятно связано с активацией в клубеньках процесса старения, т.е.деградации симбиотических структур, в которой пероксидаза и пероксидводорода также играют важную роль. Кроме того, у мутанта RisFixV(Pssym42) значительное увеличение экспрессии гена 7RA84 может бытьсвязано с преждевременной деградацией тканей клубенька.Для симбиотических мутантов SGEFix−–2 (Pssym33), SGEFix−–1(Pssym40) и RisFixV (Pssym42) активные защитные реакции наблюдались на28-й ДПИ, что проявлялось в усиленной экспрессии гена HSR203J.Дегенеративные процессы в тканях клубеньков мутантных линий SGEFix−–1(Pssym40) и RisFixV (Pssym42) также были опосредованы аккумуляциейсвободных радикалов в клетках и достигали максимума к 42-му ДПИ.Результаты и обсуждение349ABR17, принадлежащий к семейству PR10 белков, синтезируется втканях гороха в ответ на атаку патогена (Amey et al., 2008).
Ранее былопоказано,чтоинтенсивноABR17синтезируетсявнеэффективныхклубеньках, развивающихся в отсутствии бора, и аккумулируется винфицированных клетках вокруг деградирующих бактерий (Reguera et al.,2010). Было предположено, что ABR17, проявляющий рибонуклеазнуюактивность (Srivastava et al., 2006), может быть вовлечен в опосредованныйРНКазоймеханизмпредотвращениябактериальнойинфекцииипролиферации, который в нормальных условиях преодолевается ризобиямиво время формирования эффективного клубенька (Reguera et al., 2010). Этагипотеза может объяснить высокий уровень экспрессии этого гена у всехмутантных линий на 28-й ДПИ. Наблюдаемый высокий уровень экспрессииэтого гена у мутантной линии SGEFix−–1 (Pssym40) на 14-й ДПИ может бытьсвязан с массовым выходом ризобий в цитоплазму хозяйских клеток ивысоким уровнем продукции сигналов вирулентности.
В то же времяотносительно невысокий уровень транскриптов в клубеньках мутантнойлинии SGEFix−–2 (Pssym33) может быть связан с отсутствием выходабактерий из утолщенных инфекционных нитей. Изменения в уровняхэкспрессии ABR17 на 42-й ДПИ, вероятно отражает участие белков PR10 вобщем процессе старения (Reguera et al., 2010).Таким образом, различные защитные ответы запускались во времяразвития клубеньков гороха, различными симбиотическими мутациями,каждая из которых вызывала восприятие полезных ризобий в качествепотенциальных патогенов.3.12. Изучение финальной стадии дифференцировки клубеньков —старения,завершающейреализациюгенетическойпрограммысимбиогенеза(Результаты исследований, представленные в разделе 3.12., былиполучены совместно с аспиранткой ФГБНУ ВНИИСХМ Серовой ТатьянойРезультаты и обсуждениеАлександровной,руководство350кандидатскойдиссертациейкоторойосуществлено автором настоящего диссертационного исследования).Старение является финальным этапом в развитии клубенька.
В данномисследовании нами было проанализировано развитие старения у линиидикого типа SGE и серии неэффективных мутантов, блокированных наразличных стадиях развития клубеньков.3.12.1. Гистологическаяиультраструктурнаяорганизацияклубеньков у мутантов SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27)2- и 4-недельные растения, формируемые на линии дикого типа SGE,формировали недетерминированные клубеньки с типичной гистологическойзональностью (меристемой, зоной инфекции и зоной азотфиксации) иультраструктурной организацией (Рисунок 73А) (Tsyganov et al., 1998). В 4недельных клубеньках в основании клубенька начинала формироваться 4-язона — зона старения. В клубеньках мутанта SGEFix−-7 (Pssym27) зонастарения появлялась уже в 2-х недельных клубеньках, а к 4-м неделям оназанимала бóльшую часть клубенька (Рисунок 73В).
У мутанта SGEFix−-3(Pssym26) зона старения в клубеньках была больше, чем в 2-недельныхклубеньках SGEFix−-7 (Pssym27), и также увеличивалась в размерах к 4-мнеделям (Рисунок 73Б).В 2-недельных клубеньках SGEFix−-3 (Pssym26) в зоне инфекцииинфицированные клетки содержали плейоморфные бактероиды с ярковыраженными признаками морфологической дифференцировки (клетки былиувеличены в размерах, а матрикс становился более электронно-светлым, посравнению с бактериями в инфекционных нитях (Рисунок 74А, Б).
Вклубеньках мутанта зона, соответствующая зоне азотфиксации в клубенькахдикого типа, содержала бактероиды с электронно-плотным матриксом на ихкончиках (Рисунок 74В, Г). В зоне старения бактероиды внутри симбиосомподвергалисьдеградации,врезультатечегобылибактероидных и симбиосомных мембран (Рисунок 74Д, Е).видныостаткиРезультаты и обсуждение351Рисунок 73. — Гистологическая организация 4-недельных клубеньковдикого типа линии SGE (А) и мутантов SGEFix−-3 (Pssym26) (Б) иSGEFix−-7 (Pssym27) (В)I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, IV —зона старения. Наложение дифференциального интерференционногоконтраста (ДИК) и красного канала.
Красный канал — ядра и бактерии.Масштабная линейка = 100 мкм.Результаты и обсуждение352Рисунок 74. — Ультраструктурная организация клубенька у мутантаSGEFix−-3 (Pssym26)(А) Инфицированная клетка в зоне инфекции. (Б) бактероиды винфицированной клетке в зоне инфекции. (В) инфицированная клетка в зоне,соответствующей зоне азотфиксации в клубеньке дикого типа. (Г) бактероидв инфицированной клетке в зоне, соответствующей зоне азотфиксации вклубеньке дикого типа.
(Д) деградирующая инфицированная клетка в зонестарения. (Е) деградирующий бактероид в деградирующей инфицированнойклетке в зоне старения. ик — инфицированная клетка, дик — деградирующаяРезультаты и обсуждение353инфицированная клетка, ба — бактероид, дба — деградирующий бактероид,в — вакуоль. Маленькие и большие стрелки указывают электронно-плотныйматрикс в бактероидах. Масштабная линейка (А) = 5 мкм, (В, Д) = 2 мкм; (Б,Г, Е) = 500 нм.Рисунок 75. — Ультраструктурная организация клубенька у мутантаSGEFix−-7 (Pssym27)(А) Инфицированная клетка в зоне инфекции. (Б) бактероиды винфицированной клетке в зоне инфекции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
