Диссертация (1144724), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Анализпаттерновэкспрессииризобиальныхсимбиотических генов nodA и dctA на различных стадиях развитияклубенька горохаЭкспрессия конститутивного слияния npt–lacZ наблюдалась на всехстадиях развития клубенька (Рисунок 67А–Д). Экспрессия репортерногослияния dctA–lacZ была схожа с экспрессией nodA–lacZ и с экспрессией несвязанного с симбиозом слияния npt–lacZ. Поэтому приведены результаты,полученные для dctA (Рисунок 67Е-К) в сравнении с паттерном экспрессииконститутивного слияния npt–lacZ.У мутантов SGEFix−–2 (Pssym33), RisFixU (Pssym33) и RBT3 (Pssym33,Pssym40), которые блокированы на стадии выхода бактерий в цитоплазмурастительной клетки, гены nodA и dctA экспрессировались в инфекционныхнитях, сходно с npt (Рисунок 67А, Е).
Этот результат соответствует ранееописанному паттерну экспрессии гена nodA (Schlaman et al., 1991), но былнеожиданным для гена dctA. В клубеньках люцерны дикого типа экспрессияdctA S. meliloti не наблюдалась в инфекционных нитях (Boesten et al., 1998).Наблюдаемое противоречие можно объяснить тем, что у мутантов по генуPssym33, используемых в данном исследовании, инфекционные нитиувеличены по сравнению с диким типом (Tsyganov et al., 1998), облегчая темсамым визуализацию окрашивания. С другой стороны, регуляция гена dctАможет различаться между R. leguminosarum bv.
viciae и S. meliloti.Результаты и обсуждение323Рисунок 67. — Паттерны экспрессии транскрипционных слияний npt–lacZ и dctA–lacZ в клубеньках мутантов гороха, блокированных наразличных стадиях развития, и соответствующих линиях дикого типа.Сходные результаты были получены для слияния nodA–lacZ(А-Д) слияние npt–lacZ; (Е-К) слияние dctA–lacZ, (А, Е) RisFixU(Pssym33), (Б, Ж) SGEFix−–1 (Pssym40), (В, З) Sprint-2Fix− (Pssym31), (Г, И)E135f (Pssym13), (Д, К) линия дикого типа. I — меристема, II — зонаинфекции, III — зона азотфиксации, III’ — зона, соответствующая зонеазотфиксации у дикого типа, IV — зона старения, стрелки указывают наинфекционные нити.
Масштабная линейка = 0,4 мм.Результаты и обсуждениеУмутантаSGEFix−–1324(Pssym40),которыйформируетгипертрофированные инфекционные капли экспрессия генов nodA и dctA(Рисунок 67Ж) наблюдалась в клетках, содержащих гипертрофированныеинфекционные капли (клетки дистальной части клубенька) и в ювенильныхбактероидах (клетки проксимальной части клубенька).
Паттерны экспрессииэтих генов не отличались от таковых у конститутивного слияния npt–lacZ(Рисунок 67Б).У мутантных линий Sprint-2Fix− (Pssym31) и RBT (Pssym13, Pssym31),которые блокированы на стадии дифференцировки бактероидов послевыхода бактерий в цитоплазму растительной клетки, экспрессия генов nodA иdctA наблюдалась в зоне инфекции и зоне, соответствующей зонеазотфиксации у дикого типа, с паттерном сходным с таковым дляконститутивного слияния (Рисунок 67В, З).
Следует отметить, чтоокрашивание срезов клубеньков мутантных линий Sprint-2Fix− (Pssym31) иRBT (Pssym13, Pssym31), инокулированных ризобиальными штаммами,содержащими репортерные слияния dctA, требовало значительно меньшеговремени, по сравнению с другими линиями, чтобы достигнуть сходнойинтенсивности.Мутантная линия E135f (Pssym13) блокирована на поздней стадииразвития и характеризуется преждевременным появлением зоны старения, вкоторой происходит деградация симбиотических компартментов.
У этойлинии экспрессия nodA и dctA наблюдалась в зоне инфекции, в зоне,соответствующей зоне азотфиксации у дикого типа, и в некоторых клеткахзоныстарения(Рисунок67Г).Сходныйпаттерннаблюдалсядляконститутивно экспрессирующегося слияния lacZ (Рисунок 67И).Паттерны экспрессии генов nodA и dctA в клубеньках генотипов дикоготипа Sprint-2, SGE, Sparkle и Finale также был сходен с паттерном,характернымдляконститутивныхгенов:экспрессиявсехнаблюдалась в зонах инфекции и азотфиксации (Рисунок 67Д, К).слиянийРезультаты и обсуждениеЭкспрессияслияния325nodA–lacZврастительныхклеткахсдифференцированными бактероидами (в зоне азотфиксации) и клетках сбактероидами, близкими к стадии деградации (в зоне старения) оказалась длянас непредвиденной. Предыдущие исследования описывали репрессиюризобиальных nod генов сразу после выхода бактерий в цитоплазмурастительной клетки (Sharma, Signer, 1990; Schlaman et al., 1991; Schlaman etal., 1992).
Таким образом, мы могли ожидать резкое падение в интенсивностиокрашивания от середины зоны инфекции к зоне азотфиксации в клубенькахдикого типа. Одним из возможных объяснений неожиданных результатовможет быть то, что даже в случае репрессии экспрессия nodA–lacZ наплазмиде в этих зонах клубенька все еще высока, чтобы маскироватьснижение. Тем не менее, конститутивные слияния требовали одинаковоговремени для достижения сходной интенсивности в окраске.
Шламан ссоавторами (Schlaman et al., 1991) обнаружили только фоновые уровниэкспрессии nod генов, используя различные методы. Эти авторы такжепоказалиналичиерепрессора,ингибирующегосвязываниеNodDспромоторами nod генов (Schlaman et al., 1992). Ранее Тиммерс с соавторами(Timmers et al., 1998) показали, что Nod факторы продуцируются в бактерияхв инфекционных нитях и цитоплазме инфицированных клеток в зонеинфекции и все еще детектируются в бактероидах в зоне азотфиксации, но насниженном уровне. Эти факты указывают на неизвестные функцииNod-факторов на поздних стадиях развития клубенька, одной из которыхможет быть подавление защитных реакций растения-хозяина.
Таким образом,хотя nod гены репрессированы в зоне азотфиксаци, nod промоторы могут всееще поддерживать некоторый уровень экспрессии в дифференцированныхбактероидах. Также в соответствии с нашими данными результаты,полученные Тиммерсом с соавторами (Timmers et al., 1998) подтверждают,что репрессия nod генов не происходит сразу после выхода бактерий вцитоплазму растительной клетки, а является постепенным процессом,ассоциированным с дифференцировкой бактероидов.Результаты и обсуждение3263.10.2.1.
Анализ уровней экспрессии генов nodA и dctA в клубенькахгорохаМутантные линии Sprint-2Fix− (Pssym31), E135f (Pssym13) и двойнаямутантнаялинияRBT(Pssym13,Pssym31)быливыбраныдляколичественного анализа уровней экспрессии генов nodA и dctA. Также былиспользован мутант RisFixL (Pssym32), в котором дифференцировкабактероидов блокирована на сходной стадии с мутантом по гену Pssym31(Morzhina et al., 2000). Мутанты SGEFix−–2 (Pssym33), RisFixU (Pssym33) иRBT3 (Pssym33, Pssym40) были исключены из исследования, т.к.
в клеткахклубеньковобычнонеобнаруживалисьбактерии,вышедшиеизинфекционных нитей, а мутант SGEFix−–1 (Pssym40) не был включен из-замозаичной гистологической организации клубенька.Кроме описанных выше lacZ репортерных слияний (dctA, nodA and npt),были определены уровни экспрессии двух других репортерных слияний:конститутивно экспрессирующегося слияния Tn5–gusA, интегрированного вгеном штамма VF39, и геномного слияния fixN–gusA, находящегося подкислород-зависимой регуляцией.Как показал анализ поддержания устойчивости к антибиотикам,стабильность плазмид в бактериях не различалась существенно средиклубеньков, взятых от различных генотипов, как дикого типа, так имутантных, хотя наблюдались некоторые различия между плазмидами.
Так,бактерии, высеянные из клубенька, сохраняли плазмиду, содержащую nodA–lacZ слияние на уровне 12–20%, в то время как плазмида со слиянием dctA–lacZ была более стабильной (60–70%). Таким образом, любые различия,найденныемежду бактериямии бактероидами, изолированными изклубеньков различных генотипов, не могут быть вызваны различиями встабильности плазмид. Была сравнена экспрессия слияний с репортернымигенами в бактериях, изолированных из клубеньков дикого типа и мутантных.Поскольку растительные мутанты определяют блок в развитии бактероидовРезультаты и обсуждение327на определенной стадии после выхода бактерий, любые различия вэкспрессии бактериальных генов должны быть отнесены к различиям встадии развития бактероидов между различными типами клубеньков.Дляиспользованныхрепортерныхслиянийгеновнаблюдалисьнекоторые различия среди линий дикого типа (Таблица 30).
Например,ß-глюкоронидазная активность слияния fixNc–gusA была значительно выше вбактериях, изолированных из клубеньков Sprint-2 и Sparkle, чем Finale.Данная вариация может объясняться специфичными факторами растенияхозяина, которые могут влиять на уровень экспрессии бактериальных генов(Bedmar et al., 1983), что ставит нас перед необходимостью сравнениякаждого мутанта только с соответствующим генотипом дикого типа.Два нерегулируемых симбиотическим процессом слияния генов (npt–lacZ и Tn5–gusA), использованные как контроли, вели себя сходным образом,несмотря на тот факт, что одно было расположено на плазмиде (pGD499), адругое было интегрировано в геном (коэффициент корреляции активностейсреди различных линий гороха 0,87, P>0,95). Экспрессия обоих репортерныхслияний была усилена в несколько раз в клубеньках Fix− мутантов посравнению с экспрессией в клубеньках соответствующих линий дикого типа(Таблица30).Наблюдаласьобратнаякорреляциямеждууровнямиэкспрессии и степенью дифференцировки бактероидов в клубеньках:Sprint-2Fix− (Pssym31) > RisFixL (Pssym32) > E135f (Pssym13) > дикий тип(Таблица 30).
Промоторы npt и Tn5 являются конститутивными и не связаныссимбиотическимпроцессом.Внекоторойстепенионимогутрассматриваться как бактериальные гены «домашнего хозяйства», чьяэкспрессия может варьировать в соответствии с физиологическим иметаболическимсостояниемклетки.симбиотическихгеновювенильныхвУсиленнаяилиэкспрессияненеполностьюдифференцированных бактероидах соответствует предположению, что гены«домашнего хозяйства» экспрессируются в азотфиксирующих бактероидахна низком уровне (Perret et al., 1999; Margolin, 2000). Это также подтверждаетРезультаты и обсуждение328предположение, что частично дифференцированные бактероиды находятся вфизиологическом состоянии, отличном от полностью дифференцированныхбактероидов.
Кроме того, наши результаты предполагают постепенноеснижение экспрессии не симбиотических генов параллельно переходу отювенильных бактероидов к зрелым.Таблица 30. Уровни экспрессии транскрипционных слияний nodA–lacZ, dctA–lacZ и fixNc–gusA и конститутивно экспрессирующихсяслияний npt–lacZ и Tn5–gusA в клубеньках мутантных и исходных линийгорохаß-галактозидазная специфическаяактивностьГенотипSprint-2(дикий тип)ß-глюкоронидазнаяспецифическаяактивностьnpt–lacZnodA–lacZdctA–lacZfixNc–gusATn5–gusA116±2,49,9±1,08183±5,618,3±0,57203±6,72298±40,1aSprint-2Fix−(Pssym31)546±11,8a 351,3±73,94a1320±58,7a21,6±1,15aRBT(Pssym13,Pssym31)320±16,9a 553,8±28,04a1082±74,8a28,5±5,88a 1885±155,8aFinale(дикий тип)95±5,88,5±0,62414±32,510,8±0,3370±2,6RisFixL(Pssym32)b289±28,6a122,1±36,9a1327±253,1a7,6±0,23a302±80,3a(дикий тип)97±5,89,6 ± 0,78274±10,317,9±0,68160±6,7E135f(Pssym13)247±29,0a30,1±1,90a372±14,5a16,2±1,86495±6,8aSparkleСпецифическая энзиматическая активность выражена в нМ мин−1 мгбелка−1 (± ст.
ошибка)Значения средних величин различаются достоверно (P>0,95) отсоответствующих линий дикого типа (линия RBT (Pssym13, Pssym31) быласравнена с обеими линиями Sprint-2 и Sparkle).aRisFixL (Pssym32) показала высокую вариабельность междуповторностями измерений.bРезультаты и обсуждение329Экспрессия гена fixNc у штамма R. leguminosarum bv. viciae VF39 непоказала больших различий среди мутантных клубеньков или клубеньковдиких типов. Экспрессия слияния fixNc–gusA в клубеньках у мутантовSprint-2Fix− (Pssym31) и RBT (Pssym13, Pssym31) была выше в 1,2 и 1,6 раз,соответственно, чем у дикого типа Sprint-2. Напротив, в клубеньках мутантаRisFixL (Pssym32) экспрессия fixNc–gusA была в 1,4 раза ниже, чем всоответствующем диком типе Finale (Таблица 30). Хотя эти различия былистатистически достоверны, они, по-видимому, не являются биологическизначимыми, и возможно отражают вариацию, специфичную для генотипарастения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
