Диссертация (1144724), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Полученные нами данные указывают, что бактероиды вэтом мутанте еще не полностью дифференцированы, вероятно, их развитиеблокировано на более ранней стадии, чем стадия, после прохождениякоторой становится невозможным возвращение к свободноживущемусостоянию, которого достигают зрелые бактероиды. Клубеньки мутантаРезультаты и обсуждение334E135f (Pssym13) характеризуются преждевременным старением (Kneen et al.,1990), поэтому вероятно, что большое количество культивируемых бактерий,изолированных из клубеньков, может частично объясняться бактериальнойреинфекцией в зоне старения, как это было предложено ранее для стареющихклубеньков (Timmers et al., 2000).
Возможно, бактероиды в клубенькахмутанта E135f (Pssym13), хотя и показывают морфологические признакидифференцировки,могутсохранятьспособностьвозвратаксвободноживущему росту в отличие от азотфиксирующих бактероидов. Этопозволяет предположить, что потеря способности к вегетативному ростуявляетсяоднимизпоследнихэтаповразвитияазотфиксирующихбактероидов.3.11. Изучение проявления защитных реакций со стороны растенияпри реализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза(Результаты исследований, представленные в разделах 3.11.2 и 3.11.3,были получены совместно с аспиранткой ФГБНУ ВНИИСХМ ИвановойКирой Андреевной, руководство кандидатской диссертацией которойосуществлено автором настоящего диссертационного исследования).3.11.1.
Иммуноцитологическаяметилированногопектинавстенкахлокализацияинфекционныхнизконитейвсимбиотических клубеньках неэффективных мутантов горохаСостав стенки инфекционной нити в 14-ти дневных клубенькахмутантных линий и линий гороха дикого типа был исследован сиспользованием специфичного к низко-метилированному пектину антителаJIM5. В клубеньках дикого типа линии SGE антитело JIM5 равномернометило стенку инфекционной нити (Рисунок 68А, Б). Сходное распределениебыло характерно для дикого типа Finale и мутантной линии SGEFix−–1(Pssym40).
В клубеньках мутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33) (Рисунок68В, Г) и двойной мутантной линии RBT3 (Pssym33, Pssym40) (Рисунок 68Д)утолщенные стенки инфекционных нитей были более интенсивно окрашеныРезультаты и обсуждение335JIM5 по сравнению с SGE (Таблица 32). У мутантной линии RisFixV(Pssym42) JIM5 метило стенку инфекционной нити (Таблица 32), но меткараспределялась неравномерно, с образованием многочисленных кластеров(Рисунок 68Ж, З). У двойной мутантной линии RBT4 (Pssym33, Pssym42),распределение окрашивания JIM5 было сходно с таковым у SGEFix−–2(Pssym33) и двойной мутантной линии RBT3 (Pssym33, Pssym40) (Рисунок68Е; Таблица 32). У мутанта RisFixV (Pssym42) также наблюдалисьдополнительные аномалии в локализации JIM5, когда деградирующиебактероидывзонестарениябылиокруженыотложенияминизко-метилированного пектина (Рисунок 68И).Таблица 32.
Распределение частиц золота в стенках инфекционныхнитей в клубеньках линий дикого типа и мутантных линийГенотипСреднеезначениеСт. ошибкаSGE139a20,6SGEFix−–1 (Pssym40)112a18,8SGEFix−–2 (Pssym33)506b25,0RBT3 (Pssym33,Pssym40)569b39,4RBT4 (Pssym33,Pssym42)575b35,7Finale157 a22,4RisFixV (Pssym42)231c23,7Результаты представляют число золотых частиц в 1 мкм2.Представлены средние значения ± стандартная ошибка (n=20–25). Средниезначения без одинаковых букв достоверно различаются согласно критериюТьюки (P>0,999).Результаты и обсуждение336Рисунок 68.
— Иммунолокализация пектина в клетках зоны инфекции сиспользованием антител, меченных коллоидным золотом, в клубенькахгороха дикого типа и мутантовСтенка инфекционной нити (А–З) и отложение пектина вокругбактероидов (И) мечены антителом JIM5 (стрелка), который специфичен длянизко-метилированного пектина.
ин — инфекционная нить, син — стенкаинфекционной нити, б — бактерия, ба — бактероид. (А) линия дикого типаSGE, (Б) увеличенное изображение области, выделенной квадратом в (А), (В)мутантная линия SGEFix−–2 (Pssym40), (Г) увеличенное изображениеРезультаты и обсуждение337области, выделенной квадратом в (В), (Д) двойной мутант RBT3 (Pssym33,Pssym40), (Е) двойной мутант RBT4 (Pssym33, Pssym42), (Ж–И) мутантRisFixV (Pssym42), (З) увеличенное изображение области, выделеннойквадратом в (Ж). Масштабная линейка (А, В, Д, Е, Ж, И) = 500 нм), (Б, Г, З) =250 нм.3.11.2. Гистохимическаялокализацияотложенийсуберинаикаллозы в симбиотических клубеньках неэффективных мутантов горохаГистологическая организация в 21-дневных клубеньках линии дикоготипа SGE была типичной для клубеньков дикого типа и включала меристему,зону инфекции и зону азотфиксации (Рисунок 69А) (Tsyganov et al., 1998).
В42-дневных клубеньках также появлялась зона старения. Отложениясуберина в 21- и 42-дневных клубеньках были выявлены только в эндодермеклубенька, которая отделяет внутренний и наружный слои коры клубенька впостмеристематических областях (Рисунок 69Б). В клубеньках сорта Finale,также как у линии SGE отложения суберина наблюдались в эндодермеклубенька.В 21- и 42-дневных белых клубеньках мутантной линии SGEFix−–1(Pssym40) (Рисунок 69В, Д) отложения суберина наблюдались в клеточныхстенках клубеньковой эндодермы и эндодермы, окружающей сосудистыйпучок (Рисунок 69Е), при этом клубеньковая эндодерма окружаладистальную часть клубенька, приводя к его изоляции от остального растения(Рисунок 69Г).
Не было выявлено увеличения аккумуляции суберина вклеточных стенках с увеличением возраста клубенька.В 21-дневных белых клубеньках мутантной линии SGEFix−–2(Pssym33) (Рисунок 70А) отложения суберина наблюдались в клеткахрастения, через которые проходили инфекционные нити (Рисунок 70Б, Г).Суберин также накапливался в утолщенных стенках инфекционных нитей(Рисунок 70В, Г).
Усиление суберинизации наблюдалось в 42-дневныхклубеньках (данные не представлены).Результаты и обсуждение338Рисунок 69. — Гистохимическая локализация отложений суберина в 21дневных клубеньках гороха дикого типа SGE (А, Б) и мутантной линииSGEFix−–1 (Pssym40) (В-Е)(Б, Г, Е) срезы окрашены нейтральным красным. I — меристема, II —зона инфекции, III — зона азотфиксации, указаны там, где возможно ихвыделение, стрелки указывают на клубеньковую эндодерму, наконечникистрелок — эндодерма, окружающая сосудистый пучок, * — проводящиепучки. (А, В, Д) ДИК (дифференциально-интерференционный контраст), (Б,Г, Е) флуоресцентная микроскопия. (А–Г) сагиттальные срезы, (Д, Е)поперечные срезы, сделанные из средней части клубенька, соответствующейзоне инфекции в клубеньке дикого типа. Масштабная линейка = 200 мкм.Результаты и обсуждение339Рисунок 70.
— Гистохимическая локализация отложений суберина в 21дневных клубеньках мутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33)(Б, Г) срезы окрашены нейтральным красным. I — меристема,наконечники стрелок указывают на инфекционные нити, стрелки насуберинизированные стенки инфекционных нитей.
Клеточные стенки такжесуберинизированы. (А, В) ДИК (дифференциально-интерференционныйконтраст), (Б, Г) флуоресцентная микроскопия. (А, Б) сагиттальные срезы.Масштабная линейка (А, Б) = 200 мкм, (В, Г) = 20 мкм.В 21-дневных клубеньках двойной мутантной линии RBT3 (Pssym33,Pssym40), распределение суберина было сходно с таковым у мутантнойлинии SGEFix−–2 (Pssym33), при этом суберинизация также усиливалась в42-дневных клубеньках. В 21-дневных клубеньках мутантной линии RisFixV(Pssym42) не наблюдалось отложений суберина в утолщенных стенкахинфекционных нитей.
Суберин обнаруживался только в клубеньковойэндодерме, как и диком типе сорте Finale. Нами был проанализирован составутолщенных клеточных стенок зрелых инфекционных нитей в зеленоватыхклубеньках мутантной линии RisFixV (Pssym42). В отличие от дикого типаFinale (Рисунок 71А, Б), отложения каллозы были выявлены в центральнойчасти клубенька в 21- и 42-дневных клубеньках мутантной линии RisFixVРезультаты и обсуждение340(Pssym42) (Рисунок 71В, Г). Каллоза аккумулировалась в зрелых стенкахинфекционных нитей и в клеточных стенках (Рисунок 71Д, Е).
Не быловыявлено изменений, связанных с изменением возраста клубеньков. У другихмутантных линий каллоза либо не была выявлена (Рисунок 71Ж, З), либобыла найдена только в форме небольших отложений в элементах флоэмы в21- и 42-дневных клубеньков (Рисунок 71И).Рисунок 71. — Гистохимическая локализация отложений каллозы вклубеньках дикого типа Finale (А, Б), мутантной линии RisFixV(Pssym42) (В–Е) и мутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33) (Ж–И).Срезы окрашены анилиновым синим. I — меристема, II — зонаинфекции, III — зона азотфиксации, IV — зона старения указаны там, гдевозможно их выделение, ик — инфицированная клетка.
Стрелки указываютРезультаты и обсуждение341на отложения каллозы вокруг стенок инфекционных нитей, наконечникистрелок — в клеточных стенках, * сосудистые пучки. (З) автофлуоресценциясуберезированных стенок инфекционных нитей и клеточных стенок умутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33). (А, В, Д, Ж) ДИК (дифференциальноинтерференционный контраст), (Б, Г, Е, З, И) флуоресцентная микроскопия.(А–Г, Ж, З) сагиттальные срезы. Масштабная линейка (А–Г, Ж, З) = 200 мкм,(Д, Е) = 20 мкм, (И) = 50мкм.3.11.3. Анализ уровней транскриптов генов 7RA84 (пероксидаза),HSR203J (маркер реакции гиперчувствительности), и ABR17 (белокPR10) с помощью ПЦР в реальном времениС помощью ПЦР в реальном времени были оценены относительныеуровни транскриптов трех генов, вовлеченных в защитные реакции растения:7RA84 (пероксидаза), HSR203J (маркер реакции гиперчувствительности), иABR17 (белок PR10).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
