Диссертация (1144724), страница 54
Текст из файла (страница 54)
(В) инфицированная клетка в зоне,Результаты и обсуждение354соответствующей зоне азотфиксации в клубеньке дикого типа. (Г) бактероидв инфицированной клетке в зоне, соответствующей зоне азотфиксации вклубеньке дикого типа. (Д) деградирующая инфицированная клетка в зонестарения. (Е) деградирующий бактероид в деградирующей инфицированнойклетке в зоне старения.
ик — инфицированная клетка, дик — деградирующаяинфицированная клетка, ба — бактероид, дба — деградирующий бактероид,пбп — перибактероидное пространство, в — вакуоль. Большие стрелкиуказывают электронно-плотные включения в бактероидах, наконечникистрелок указывают инфекционные нити, звездочки — амилопласты,маленькие стрелки — деградирующие симбиосомы в вакуоле. Масштабнаялинейка (А) = 5 мкм, (В, Д) = 2 мкм; (Б, Г, Е) = 500 нм.В2-хнедельныхклубенькахмутантаSGEFix−-7(Pssym27)инфицированные клетки в зоне инфекции содержали бактероиды спризнаками морфологической дифференцировки (Рисунок 75А, Б). В зоне,соответствующейбактероидахзонеазотфиксациинаблюдалисьнебольшиевклубенькахдикогоэлектронно-плотныетипа, ввключения(Рисунок 75В, Г). В зоне старения у бактероидов наблюдались признакидеградации внутри симбиосом, при этом были значительно увеличеныперибактероидные пространства (Рисунок 75Д, Е).
Наблюдались разрывытонопласта и присутствие деградированных бактероидов в вакуоле (Рисунок75Д), инфицированные клетки содержали амилопласты (Рисунок 75В, Д).Некоторыеинфицированныевключения в цитоплазме.клеткисодержалибольшиелипидныеРезультаты и обсуждение3553.12.2. Анализ уровней транскриптов генов, ассоциированных состарением, в клубеньках дикого типа SGE и мутантных линий3.12.2.1.
Гены цистеиновой протеазы 1 (PsCyp1), цистеиновойпротеазы 15a (PsCyp15a) и тиоловой протеазы (PsTPP)Рисунок 76. — Относительные уровни транскриптов PsCyp1, PsCyp15a,PsTPP и PsATB2 в 2-, 4- и 6-недельных клубеньках гороха дикого типаSGE и мутантах SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3(Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27)Буквы (a, b, c) указывают достоверные различия (P≤0,05): a — от линиидикого типа SGE на одном сроке; b — внутри генотипа при сравнении с 2-хнедельными клубеньками, c — внутри генотипа при сравнении с 4-хнедельными клубеньками.Результаты и обсуждениеСувеличениемтранскриптовгеноввозрастаPsCyp1,проанализированных356клубеньковPsCyp15aгенотипов.УровнииотносительныеPsTPPрослитранскриптовэтихуровниувсехгеновзначительно увеличивались к 4-й неделе (на этой стадии наблюдается пиказотфиксации в клубеньках дикого типа), по сравнению с 2-недельнымиклубеньками у мутантов SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-3 (Pssym26) иSGEFix−-7 (Pssym27) (Рисунок 76А–В).
Тем не менее, только слабоеувеличение количества транскриптов PsCyp1 и PsCyp15 наблюдалось вовремя увеличения возраста клубеньков у мутанта SGEFix−-2 (Pssym33)(Рисунок 76А, Б). Относительный уровень транскриптов PsTPP значительноне увеличивался в клубеньках SGEFix−-2 (Pssym33) и даже слегка снижался к6-й НПИ (Рисунок 76В). К 4-й НПИ уровени транскриптов генов,кодирующих цистеиновые и тиоловые протеазы, в клубеньках мутантовSGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7(Pssym27) были значительно выше, чем в клубеньках дикого типа (Рисунок76А–В). В клубеньках дикого типа уровни транскрипции этих геновзначительно возрастали только к 6-й НПИ (Рисунок 76А–В). Наиболеесильное увеличение уровня транскриптов в 7,4 раза детектировалось дляPsCyp15a (Рисунок 76Б).3.12.2.2.
Ген,кодирующийbZIPтранскрипционныйфактор(PsATB2)Уровни транскриптов PsATB2 возрастали с увеличением возрастаклубеньков.Вовсехмутантныхгенотипахувеличениеколичестватранскриптов PsATB2 наблюдалось уже к 4-й НПИ (Рисунок 76Г).Наибольшее увеличение уровня транскриптов наблюдалось в 4-недельныхклубеньках мутанта SGEFix−-3 (Pssym26) при сравнении с 2-недельнымиклубеньками (Рисунок 76Г). К 4-м НПИ количество транскриптов PsATB2 вклубеньках SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3 (Pssym26)и SGEFix−-7 (Pssym27) было выше, чем у дикого типа (Рисунок 76Г). ВРезультаты и обсуждение357клубеньках дикого типа количество транскриптов PsATB2 значительноувеличивалось (в 6,7 раза) только к 6-й НПИ.
В то же время количествотранскриптов PsATB2 было снижено к 6-й НПИ у мутантов SGEFix−-2(Pssym33), SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) (Рисунок 76Г).3.12.2.3. Гены,1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтазы2(PsACS2) и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидазы 1 (PsACO1)Сувеличением возраста клубеньковувеличивалось количествотранскриптов генов, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза этилена.Уровни транскриптов PsACS2 были выше в 4-недельных клубеньках, посравнению с 2-недельными, у SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-3 (Pssym26), иSGEFix−-7 (Pssym27) (Рисунок 77А).
Тем не менее, такого рода увеличение ненаблюдалось в клубеньках SGEFix−-2 (Pssym33) (Рисунок 77А). Увеличениеуровня PsACO1 также наблюдалось в 4-недельных клубеньках всехпроанализированных мутантов (Рисунок 77Б). Наибольшее увеличение былоотмечено у мутантов SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) (Рисунок77Б). В 4-недельных клубеньках количество транскриптов PsACS2 и PsACO1было выше у SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3(Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27), чем в клубеньках дикого типа (Рисунок77А, Б).
В клубеньках дикого типа уровень транскриптов PsACS2значительно увеличивался (в 15 раз) только через 6 НПИ, а уровеньтранскриптов PsACO1 увеличивался в 3 раза через 4 НПИ (Рисунок 77А, Б).Результаты и обсуждение358Рисунок 77. — Относительные уровни транскриптов PsACS2, PsACO1 иPsAO3 в 2-, 4- и 6-недельных клубеньках гороха дикого типа SGE имутантах SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3 (Pssym26)и SGEFix−-7 (Pssym27)Буквы (a, b, c) указывают достоверные различия (P≤0,05): a — от линиидикого типа SGE на одном сроке; b — внутри генотипа при сравнении с 2-хнедельными клубеньками, c — внутри генотипа при сравнении с 4-хнедельными клубеньками.3.12.2.4.
Ген, кодирующий альдегид оксидазу 3 (PsAO3)Уровень транскриптов гена PsAO3, который кодирует фермент,катализирующий финальную стадию биосинтеза абсцизовой кислоты,увеличивался в большинстве линий во время старения клубеньков.Увеличение количества транскриптов PsAO3 наблюдалось у мутантовРезультаты и обсуждение359SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) к 4-й НПИ(Рисунок 77В).
Уровень транскриптов достоверно не изменялся во времястарения клубеньков SGEFix−-2 (Pssym33). К 4-й НПИ уровень транскриптовPsAO3 в клубеньках SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-3(Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) был выше, чем в клубеньках дикого типа(Рисунок 77В). К 6-й НПИ уровень транскриптов PsAO3 увеличивался вклубеньках дикого типа в 6,3 раза (Рисунок 77В).Важно отметить, что в отличие от других мутантов, в 2-недельныхклубеньках SGEFix−-2 (Pssym33) наблюдался более высокий уровеньтранскриптов, по сравнению с диким типом, для всех проанализированныхгенов (Рисунок 76А-Г, Рисунок 77А-В).3.12.3. Транскрипционныепаттерныассоциированныхсостарением генов в клубеньках дикого типа SGE и мутанта SGEFix−-7(Pssym27), определенные с помощью лазерной микродиссекцииДля выявления возможной специфичности в паттернов экспрессиигенов, ассоциированных со старением, в различных зонах клубенька, былаиспользована лазерная микродиссекция.С помощью лазерной микродиссекции в клубеньках дикого типа SGE имутанта SGEFix−-7 (Pssym27) были определены транскрипционные паттерны7-ми ассоциированных со старением генов.
Инфицированные клетки из зоныIII были вырезаны из 2-недельных клубеньков дикого типа SGE (Рисунок 78),из 4-недельных клубеньков были вырезаны инфицированные клетки из зоныIII и зоны IV (Рисунок 79). У мутантной линии SGEFix−-7 (Pssym27) из 2недельныхклубеньковбыливырезаныинфицированныеклетки,соответствущие зоне III в клубеньках дикого типа (зона III′) и из хорошоразличимой зоны IV (Рисунок 80).Были выявлены различия в транкрипционных паттернах среди генов,кодирующих протеазы. У дикого типа количество транскриптов PsCyp15aбыло в 3,3 раза выше в зоне III 4-недельных клубеньков, по сравнению с 2-Результаты и обсуждениенедельными(Рисунок81А).360Ненаблюдалосьразличийвуровняхтранскриптов PsTPP (Рисунок 81Б).
Тем не менее, слабое уменьшение в 1,5раза и увеличение в 1,6 раза количества транскриптов PsCyp15a и PsTPP,соответственно, наблюдалось в зоне IV, по сравнению с зоной III вклубеньках дикого типа (Рисунок 81А, Б). У мутанта SGEFix−-7 (Pssym27),самое высокое увеличение количества транскриптов PsCyp15a и PsTPP в 13,2и 14 раз, соответственно, наблюдалось в зоне IV, по сравнению с зоной III′(Рисунок 81А, Б). Количество транскриптов PsCyp15a и PsTPP было в 6,6 и2,8 раза выше, соответственно, в зоне III′ мутантных клубеньков, посравнению с зоной III 2-недельных клубеньков дикого типа (Рисунок 81А, Б).В то же время транскрипты PsCyp1 не выявлялись в инфицированныхклетках как в клубеньках дикого типа, так и мутантных.Уровни транскриптов PsATB2 возрастали во время деградации клетокклубеньков дикого типа и мутанта.
В зоне III клубеньков дикого типаколичество транскриптов PsATB2 было в 2,5 раза выше в 4-недельныхклубеньках, по сравнению с 2-недельными (Рисунок 81В). В 4-недельныхклубеньках уровень транскриптов PsATB2 был в 1,4 раза выше в зоне IV, чемв зоне III. В мутантных клубеньках самое высокое повышение уровнятранскриптов PsATB2 (в 27,2 раза) наблюдалось в зоне IV относительно зоныIII′. В 2-недельных клубеньках уровень транскриптов PsATB2 в зоне III′ был в8,7 раза выше, чем в зоне III клубеньков дикого типа (Рисунок 81В).Уровни транскриптов PsAO3 увеличивались во время старенияклубеньков дикого типа и мутанта. В клубеньках дикого типа уровеньтранскриптов PsAO3 в зоне III был в 5,4 раза выше в 4-недельныхклубеньках, чем у 2-недельных (Рисунок 81Г), но не различался достоверномежду зонами III и IV в 4-недельных клубеньках.
В мутантных клубенькахсамое значительное увеличение (в 40 раз) уровня транскриптов PsAO3наблюдалось в зоне IV, по сравненеию с зоной III′. В 2-недельныхклубеньках уровень транскриптов PsAO3 был в 2,5 раза выше в зоне III′, посравнению с зоной III (Рисунок 81Г).Результаты и обсуждение361Уровни транскриптов PsACS2, который кодирует фермент биосинтезапредшественника этилена — АЦК, снижались во время деградацииинфицированных клеток в клубеньках дикого типа и мутанта. ТранскриптыPsACS2 не были выявлены в зоне III 4-недельных клубеньков дикого типа(Рисунок 81Д). В клубеньках дикого типа количество транскриптов PsACS2было в 16,2 раза ниже в зоне IV 4-недельных клубеньков, чем в зоне III 2недельных клубеньков. В клубеньках мутанта уровень транскриптов PsACS2был в 3,7 раза ниже в зоне IV, чем в зоне III′.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
