Диссертация (1144724), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Также мы наблюдали ряд ранееРезультаты и обсуждение371неописанных признаков старения клубеньков. У мутанта SGEFix−-3(Pssym26) наблюдался электронно-плотный матрикс, который формировал«шапочку»накончикебактероида.Электронно-плотныевключениянаблюдались в клубеньках мутанта SGEFix−-7 (Pssym27). Биологическоезначение этих электронно-плотных структур неясно. Мутант SGEFix−-3(Pssym26) показал более выраженное старение бактероидов, с полностьюдеградированнымибактероидамиисимбиосомамив2-недельныхклубеньках. У мутанта SGEFix−-7 (Pssym27) бактероиды не были полностьюдеградированными, но наблюдалась потеря целостности тонопласта, чтоявляется индикатором программированной клеточной гибели (van Doorn,2011), которая часто наблюдается во время старения клубеньков бобовыхрастений (Chua et al., 1985; Banba et al., 2001; Chungopast et al., 2014).
Также винфицированныхклеткахмутантааккумулировалисьмногочисленныеамилопласты, что является признаком неэффективности клубеньков (Forrestet al., 1991).Мыпровелисравнениетранскрипционныхпаттернов7ассоциированных со старением генов у мутантов и линии дикого типа. Этигены кодируют цистеиновые протеазы 1 (PsCyp1) и 15a (PsCyp15a),тиоловую протеазу (PsTPP), транскрипционный фактор bZIP (PsATB2),альдегид оксидазу 3 (PsAO3), АЦК синтазу 2 (PsACS2) и АЦК оксидазу 1(PsACO1). Известно, что все эти гены участвуют в старении клубенька.
Гены,кодирующиецистеиновыепротеазы,являютсянаиболееактивноэкспрессирующимися генами во время старения клубенька (Kardailsky,Brewin, 1996; Van de Velde et al., 2006). Старение клубенька такжесопровождается увеличением уровня транскриптов MtATB2 (D’haeseleer et al.,2010). Фитогормоны абсцизовая кислота (González et al., 2001) и этилен(Guinel, 2015) играют позитивную роль в старении клубенька.В клубеньках линии дикого типа SGE, уровни транскриптов 7 генов,ассоциированных со старением, значительно увеличивались только к 6-йНПИ.
Ранее сходная активация этих генов была показана нами в 6-недельныхРезультаты и обсуждение372клубеньках линии гороха Sprint-2 и сорта Sparkle (Serova et al., 2017).Клубеньки гороха формируются уже ко 2-й НПИ и пик азотфиксациинаблюдается на 3-й и 4-й НПИ. У гороха старение клубеньков активнопроявляется к 6-й НПИ, что подтверждается усилением транскрипциимаркерных генов старения.
У мутантов по генам Pssym26, Pssym27 иPssym40, чьи клубеньки проявляют признаки раннего старения, уровнитранскриптов маркерных генов старения увеличивались уже к 4-й НПИ.Высокие уровни транскриптов маркерных генов старения наблюдались вклубеньках мутанта SGEFix−-2 (Pssym33), который не проявляет фенотипраннего старения. Ранее мы наблюдали увеличенные уровни транскриптовгенов, ассоциированных со старением, у мутантов E135F (Pssym13) и Sprint2Fix− (Pssym31) (Serova et al., 2017); первый мутант проявляет фенотипраннего старения (Kneen et al., 1990), а второй — не проявляет (Borisov et al.,1997).Несмотря на выраженную активацию генов, ассоциированных состарением, в клубеньках всех проанализированных мутантов, наблюдалисьнекоторые различия в транскрипционных паттернах определенных геновмежду мутантами.
Например, уровни транскриптов PsCyp1, PsCyp15a,PsACS2, and PsACO1 были выше в клубеньках SGEFix−-7 (Pssym27), чем уSGEFix−-3 (Pssym26). Уровни транскриптов PsTPP и PsATB2 были выше уSGEFix−-3 (Pssym26), чем у других мутантов. Уровень транскриптов PsAO3был выше у SGEFix−-7 (Pssym27), чем у SGEFix−-3 (Pssym26) к 4-й НПИ, ноне различался достоверно к 6-й НПИ. Биологическое значение этих различийна сегодняшний день трудно интерпретировать.
Выявление нуклеотидныхпоследовательностей генов PsSym26 и PsSym27 и определение функцийпродуктов этих генов может помочь объяснить различия в паттернахэкспрессии между мутантами. Среди изученных мутантов SGEFix−-2(Pssym33) показал самый высокий уровень транскриптов PsCyp1, PsATB2,PsACO1 и PsAO3 в 2-недельных клубеньках, уровни транскрипции геновPsCyp15a, PsTTP и PsACS2 также увеличивался в 2-недельных клубеньках,Результаты и обсуждениепосравнениюсдиким373типом.Такаяранняяактивациягенов,ассоциированных со старением, находится в соответствии с тем фактом, чторазвитие клубеньков у этого мутанта блокировано на самой ранней стадиисреди изученных мутантов.
В то же время уровень транскриптов PsTPP неизменялся с увеличением возраста клубеньков у SGEFix−-2 (Pssym33).Учитывая, что у данного мутанта отсутствует выход бактерий в цитоплазмурастительной клетки (Tsyganov et al., 1998), можно предположить, чтотиоловая протеаза PsTPP может быть важна для деградации симбиосом.С использованием лазерной микродиссекции экспрессия генов,ассоциированныхсостарением,былапроанализировананауровнеразличных зон клубенька у линии дикого типа и мутанта SGEFix−-7(Pssym27). Мутант SGEFix−-7 (Pssym27) показал увеличенную транскрипциюгенов, ассоциированных со старением, в зоне, соответствующей зонеазотфиксации в диком типе. Сходное увеличение уровней транскриптовгенов, ассоциированных со старением, по сравнению с диким типом Sparkle,наблюдалось нами ранее у мутанта E135F (Pssym13) (Serova et al., 2017).
Темне менее транскрипты PsCyp1 не детектировались в клетках клубеньковдикого типа и мутанта SGEFix−-7 (Pssym27). Это подтверждает, что протеазаPsCyp1 не вовлечена в старение центральной части клубенька, а можетучаствовать в старении периферических тканей клубенька.Иммунолокализация показала, что уровни АЦК увеличиаются сувеличением возраста клубеньков дикого типа.
Увеличение интенсивностиокрашивания коррелировало с увеличением транскрипции PsACS2 и PsACO1.Сходные паттерны аккумуляции АЦК и транскрипции PsACS2 и PsACO1ранее наблюдались нами в клубеньках генотипов дикого типа Sparkle иSprint-2 (Serova et al., 2017). У мутантов SGEFix−-1 (Pssym40), SGEFix−-2(Pssym33), SGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) максимальныйуровень АЦК наблюдался в 10-дневных клубеньках и уменьшался сувеличением возраста клубеньков.
Этот паттерн указывает на раннююактивацию старения клубеньков у этих мутантов.Результаты и обсуждение374Таким образом, в ходе проведенных исследований была показанаактивация транскрипции ряда генов, ассоциированных со старениемклубеньков, таких как PsCyp15a, PsTPP, PsATB2, PsAO3 и PsACO1. Данныегены могут рассматриваться как адекватные молекулярные маркеры старениясимбиотических клубеньков гороха.
Также показана возможная позитивнаярегуляция старения симбиотических клубеньков со стороны абсцизовойкислоты и этилена. Индуцированное растительными мутациями раннеестарение клубеньков активируется сильнее, чем естественное старение.Вероятно, что старение клубенька является универсальной реакциейрастения на его неэффективность.3.13. Получение генетической модели для исследования влияниякадмия на развитие симбиотических клубеньков у гороха3.13.1. ЭМС мутагенез и скрининг мутантов с повышеннойустойчивостью к кадмиюСемена лабораторной линии SGE были мутагенезированы с помощьюЭМС, как было описано ранее (Борисов et al., 1994). Для получения семянпоколения M2 мутагенизированные семена M1 были посажены в вермикулитна среду с полным минеральным питанием.
Семена 350 семей поколения M2были помещены в пластиковые контейнеры (около 100 семян на контейнер),содержащие 3 л питательного раствора (100 мМ KH2PO4, 50 мМ Ca(NO3)2,400 мМ MgSO4,300 мМ KCl, 70 мМ CaCl2, 5 мМ NaCl, 2 Fe-тартрат, 1 мМH3BO3, 1 мМ MnSO4, 1 мМ ZnSO4, 0.03 мМ Na2MoO4, 0.8 мМ CuSO4, pH 5,5).Семена выращивались в течение 5-ти дней, после чего питательный растворбыл заменен с добавлением к нему 8 мкМ CdCl2. После культивирования втечение 4-х дней, питательный раствор был заменен с добавлением к нему 6мкМ CdCl2.
В дальнейшем раствор заменялся каждые 4 дня с добавлением кнему 6 мкМ CdCl2. В предварительных экспериментах выбранныеконцентрации CdCl2 полностью останавливали рост корней у линии дикоготипа SGE. Рост проростков проверили на 17-й день культивирования.Результаты и обсуждение375Проростки в одной из M2 семей показали лучший рост стеблей и былиспособны формировать боковые корни при 6 мкМ CdCl2.
Эти проросткибыли перенесены в вермикулит и от них были получены семена растенийпоколений M3 и M4.3.13.2.Гибридологическийанализмутантасповышеннойустойчивостью к кадмиюРастения M4, происходящие от одного устойчивого в М2 проростка,были скрещены с растениями дикого типа SGE. Гибридологический анализпоказал,чтомутантхарактеризуетсямоногеннымнаследованием ирецессивным проявлением фенотипа (Таблица 33). Сегреганты F2 смутантным фенотипом были отобраны для последующего получения семян.На их основе после селекции в ряду 5-ти поколений была создана стабильнаямутантная линия SGECdt.Таблица 33. Анализ расщепления растений поколения F2 отреципрокных скрещиваний кадмий-устойчивого мутанта и линиидикого типа SGEСкрещиваниеЧисло растений F2χ23:1CdCd устойчивыечувствительныеSGE x Cd-устойчивыймутант92310,003Cd-устойчивый мутантx SGE50130,640Всего142440,179Растения были выращены в питательном растворе с добавлением 6мкM CdCl2.3.13.3.
Анализ содержания кадмия у линии дикого типа SGE имутанта SGECdtПри выращивании растений линии дикого типа SGE и мутанта SGECdt вгидропонике количество кадмия в корнях и побегах мутанта SGECdtРезультаты и обсуждение376превышало аналогичный параметр линии SGE в 1,5-2 раза в зависимости отусловий эксперимента (Таблица 34).Таблица 34. Содержание кадмия в корнях и побегах линии дикогоSGE и мутанта SGECdtУсловия воздействияСодержание кадмия, ppmКорниСтеблиSGESGECdtSGESGECdt1 мкМ CdCl2, 3 недели1028220613,2525,066 мкМ CdCl2, 2 суток--29,7844,196 мкМ CdCl2, 7 суток1014150838,0103При выращивании растений дикого типа SGE и мутанта SGECdt впочвенно-песчаной смеси, содержащей различные концентрации CdCl2, прианализе содержания кадмия была выявлена значительная разница в егонакоплении между вариантами. Как в побегах, так и в семенах кадмийинтенсивнее накапливался у мутанта SGECdt (Таблица 35).Таблица 35.
Содержание кадмия в семенах и побегах линии дикоготипа SGE и мутанта SGECdtУсловия воздействияСодержание кадмия, ppmКорниСтеблиSGESGECdtSGESGECdt5 мг/кг CdCl23,075,073,638,5215 мг/кг CdCl24,467,829,1415,56Очевидно, что при выращивании растений в гидропонике, кадмийнакапливается значительно активней, что объясняется тем, что в почвеннойсмеси значительная часть кадмия оказывается связанной и недоступна дляпоглощения растениями.Результаты и обсуждение3.13.4.Анализвлияния377хлоридакадмиянаорганизациюмикротрубочек в кончиках корней линии дикого SGE и мутанта SGECdtПоскольку тубулиновый цитоскелет крайне чувствителен к действиюкадмия, была проанализирована организация микротрубочек у линии дикоготипа SGE и мутанта SGECdt.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
