Диссертация (1144724), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Масштабная линейка (А,В, Д) = 5 мкм, (Б, Г, Е) = 1 мкм.Рисунок 100. — Ультраструктурная организация клубеньков горохамутанта SGECdt при воздействии 100 мкМ CdCl2(А, В) инфицированная клетка из зоны азотфиксации. (Б)инфицированная клетка из зоны инфекции. (Д) симбиосомы винфицированной клетке из зоны азотфиксации. ик — инфицированнаяклетка, я — ядро, кс — клеточная стенка, ин — инфекционная нить, ика —инфекционная капля, ба — бактероид, мс — образующаяся в результатеслияния симбиосома, содержащая несколько бактероидов. Стрелкиуказывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелок указывают наразрушение симбиосомных мембран. Масштабная линейка (А) = 5 мкм, (В) =2 мкм, (Б, Г) = 1 мкм.Результаты и обсуждение4003.13.8.3 Ультраструктурнаяорганизациясимбиотическихклубеньков гороха линии дикого типа SGE и мутанта SGECdt привоздействии 1000мкМ CdCl2.В зрелых клубеньках линии дикого типа SGE наблюдалось нарушениезональности (Рисунок 97Д).
Инфицированные клетки зоны азотфиксациичасто имели неровную, складчатую поверхность. В зоне азотфиксации истарения также наблюдались межклеточные пространства с оптическиплотным содержимым, являющиеся разрушенными инфицированнымиклетками.Зрелые клубеньки мутанта SGECdt имели строение, близкое к норме(Рисунок 97Е). В то же время молодые, неправильной формы клубенькихарактеризовалисьотсутствиемчетконарушениемвыраженнойзональности:зоныредукциейинфекции,меристемы,наличиемвзонеазотфиксации инфицированных клеток с признаками деградации и большогоколичества неинфицированных клеток (данные не представлены).В зрелых клубеньках линии дикого типа SGE наблюдались признакираннего старения (Рисунок 101А, В, Д).
Зона инфекции была представленанебольшим количеством клеток. Они содержали симбиосомы с увеличеннымперибактероидным пространством. В зоне азотфиксации симбиосомыхарактеризовалисьувеличеннымперибактероиднымпространствомискладчатой симбиосомной мембраной. В большинстве клеток симбиосомныемембраныбыличастичноилиполностьюразрушены,встречалисьдеградирующие бактероиды (Рисунок 101Б). В клубеньках наблюдалась зонастарения, содержащая клетки с полностью разрушенной цитоплазмой идеградирующими, свободно расположенными бактероидами (Рисунок 101В,Д). Бактероиды приобретали неправильную форму, складчатую поверхность(Рисунок 101Г), матрикс в них частично или полностью просветлялсяРезультаты и обсуждение401(Рисунок 101Е).
Встречались клетки, заполненные «тенями» бактероидов(Рисунок 101Д).Рисунок 101. — Ультраструктурная организация клубеньков горохалинии дикого типа SGE при воздействии 1000 мкМ CdCl2(А, В, Д) инфицированные клетки из зоны азотфиксации с различнойстепенью деградации. (Б, Г, Е) ультраструктурные особенности организацииРезультаты и обсуждение402симбиосом в инфицированных клетках из зоны азотфиксации. ик —инфицированная клетка, дик — деградирующая инфицированная клетка, я —ядро, в — вакуоль, кс — клеточная стенка, ин — инфекционная нить, ба —бактероид, дба — деградирующий бактероид, мс — образующаяся врезультате слияния симбиосома, содержащая несколько бактероидов.Стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечники стрелокуказывают на разрушение симбиосомных мембран.
Масштабная линейка (А,В, Д) = 5 мкм, (Б, Г, Е) = 1 мкм.В зрелых клубеньках мутанта SGECdt с гистологическим строением,наиболее близким к норме, мембраны бактероидов в зоне инфекциихарактеризовалисьповышеннойскладчатостью.Перибактероидноепространство в симбиосомах было увеличено, симбиосомные мембраны внекоторых клетках зоны инфекции были частично разрушены, в результатечего ювенильные бактероиды высвобождались в вакуоль (Рисунок 102Д). Взоне азотфиксации часть инфицированных клеток содержало симбиосомы сизмененным«несимметричноувеличенным»перибактероиднымпространством (Рисунок 102А, В).
В других клетках перибактероидноепространство симбиосом не было увеличено, хотя встречались признакислияния симбиосом (Рисунок 102Б). В молодых клубеньках с отсутствиемчеткой зональности в инфицированных клетках наблюдалась ранняядеструкция симбиосом и хозяйской цитоплазмы. Происходило частичноеразрушение симбиосомных мембран, слияние симбиосом (Рисунок 102Г),усиливалась складчатость симбиосомных мембран, матрикс бактероидовстановился неоднородным и содержал просветленные участки и электроннопрозрачные гранулы (Рисунок 102Е).Таким образом, наиболее выраженные изменения ультраструктурнойорганизации наблюдались в клубеньках гороха линии дикого типа SGE привоздействии 1000мкМ CdCl2.
Они проявлялись в увеличении зоны старения,деградации цитоплазмы и органелл клеток растения-хозяина, нарушениистроения инфекционных нитей, разрушением симбиосомных мембран,слиянием симбиосом и деградацией бактероидов. У мутанта SGECdtРезультаты и обсуждение403изменения инфекционных структур носят гораздо менее выраженныйхарактер.Рисунок 102.
— Ультраструктурная организация клубеньков горохамутанта SGECdt при воздействии 1000 мкМ CdCl2А и В — инфицированные клетки из зоны азотфиксации с различнойстепенью деградации. Д — инфицированная клетка из зоны инфекции. Б, Г иРезультаты и обсуждение404Е — ультраструктурные особенности организации симбиосом винфицированных клетках из зоны азотфиксации. ик — инфицированнаяклетка, в — вакуоль, кс — клеточная ин — инфекционная нить, ика —инфекционная капля, ба — бактероид, дба — деградирующий бактероид, мс— образующаяся в результате слияния симбиосома, содержащая несколькобактероидов. Стрелки указывают на симбиосомную мембрану, наконечникистрелок указывают на разрушение симбиосомных мембран, * — амилопласт.Линейка: А — 2 мкм, Б — 5 мкм, В-Е — 1 мкм.Количествоисследованийвлияниякадмиянаразвитиеифункционирование симбиотических клубеньков невелико. Так, для люпинабелого было показано, что при выращивании растений при 18 мкМ Cd2+происходили изменения в гистологической и ультраструктурной организацииклубенька.
Было отмечено заполнение гликопротеинами межклеточныхпространств, а также деградация бактероидов в инфицированных клетках(Carpenaetal.,При2003).исследованиивлияниякадмиянафункционирование клубеньков сои было показано, что с увеличениемконцентрации кадмия уменьшается зона азотфиксации в клубеньке и числоинфицированныхклеток.Такженаблюдалисьизменениявультраструктурной организации клубеньков: при высоких концентрацияхкадмия уменьшалось число бактероидов в симбиосомах (Chen et al., 2003).Для гороха влияние кадмия на развитие клубеньков было исследовано у двухгенотипов гороха: VIR8456 и VIR3429. При концентрации в почве 4,4 ppmклубеньки формообразца VIR8456 проявляли меньшую устойчивость, в нихнаблюдалисьдеградацияперибактероидныхмембраниаккумуляцияэлектронно-плотных включений. При концентрации в почве 22 ppmаномалии на ультраструктурном уровне наблюдались в клубеньках обоихгенотипов, но у VIR8456 они были выражены сильнее (Ausili et al., 2002).Результаты и обсуждение3.14.
Получениеизучение405трансгенныхвозможностисозданияштаммовиR.иleguminosarumиспользованиярастительно-микробной системы для фиторемедиации почв, загрязненных кадмиемВ связи с обнаруженной в предыдущем разделе изменчивости поспособности аккумулировать кадмий, было решено создать симбиотическуюсистему, способную аккумулировать кадмий, для чего были получены дватрансгенных штамма Rhizobium leguminosarum bv. viceae 3841-PsMT1 и 3841PsMT2.3.14.1 Создание генетических конструкций nifH-PsMT1 и nifHPsMT2Для получения штаммов были созданы генетические конструкции nifHPsMT1 и nifH-PsMT2.
Генетические конструкции представляют собойкодирующие области растительных генов PsMT1, PsMT2, слитые спромоторной областью гена nifH клубеньковых бактерий гороха. Ген nifH,кодирующий малую субъединицу нитрогеназы, имеет «сильный» промотор,обеспечивающийстабильнуютранскрипциюнаходящегосяподегоконтролем гена в микроаэрофильных условиях, создаваемых, в частности, всимбиотических клубеньках.
Гены гороха PsMT1 и PsMT2 кодируютметаллотионеины — небольшие (89 и 88 а.к.) богатые цистеином белки,синтезирующиеся в клетках растений в ответ на воздействие тяжелыхметаллов и специфично связывающиеся с ними.Фрагменты ДНК, содержащие кодирующие области генов PsМТ1 иPsМТ2, также как фрагмент ДНК, содержащий промоторную областьризобиального гена nifH, были ПЦР-амплифицированы.Полученные ПЦР-фрагменты были выделены из геля, далее былипроведены реакции лигирования фрагментов между собой по тупым концам(nifH с PsМТ1 и nifH с PsМТ2). На следующем этапе была проведена ПЦРамплификация полученных слияний.
Для этого в качестве матрицы былииспользованы лигазные смеси, а в качестве праймеров — следующиеРезультаты и обсуждение406комбинации: nifH-FOR и MT1-REV (для конструкции с геном PsМТ1), nifHFOR и MT2-REV (для конструкции с геном PsМТ2). В итоге был полученДНК-фрагмент размером 1018 пн (содержит ген PsМТ1, слитый спромотором nifH) и фрагмент размером 1014 пн (содержит ген PsМТ2,слитый с промотором nifH).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
