Диссертация (1144724), страница 61
Текст из файла (страница 61)
— Содержание кадмия в корнях с клубеньками приинокуляции линии гороха дикого типа SGE и мутанта SGECdt исходнымштаммом R. leguminosarum bv. viceae 3841 и трансгенными штаммами3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 в условиях отсутствия CdCl2 и придобавлении 0,5 мкМ CdCl21614121086420SGE3841SGE3841PsMT1SGE3841PsMT2SGECdt3841SGECdt3841PsMT1SGECdt3841PsMT2Рисунок 106. — Содержание кадмия в стеблях при инокуляции линиигороха дикого типа SGE и мутанта SGECdt исходным штаммомR. leguminosarum bv.
viceae 3841 и трансгенными штаммами 3841-PsMT1и 3841-PsMT2 в условиях отсутствия CdCl2 и при добавлении0,5 мкМ CdCl2Результаты и обсуждение4133.14.7 Анализ экспрессии генов PsMT1 и PsMT2 в клубенькахрастенийгороха,инокулированныхтрансгеннымиштаммамиR leguminosarum 3841-PsMT1 и 3841-PsMT2Анализ уровней транскриптов гена PsMT1 выявил их высокий уровеньв контрольных вариантах растений, инокулированных не содержащимиданный ген штаммами (Рисунок 107), что указывает на важную рольметаллотионеина PsMT1 в поддержании гомеостаза клубеньков.
В то жевремя увеличение уровня транскриптов данного гена при кадмиевом стрессе,говорит о том, что ген PsMT1 вовлечен и в нивелирование токсичногодействия кадмия у линии дикого типа (Рисунок 107).При анализе уровней транскриптов гена PsMT2 было выявленозначительное их увеличение в клубеньках, образованных штаммом 3841PsMT2 как на корнях линии SGE, так и на корнях мутантной линии SGECdt.При этом добавление хлорида кадмия не приводило к значительномуувеличению уровня транскриптов PsMT2 (Рисунок 108). Незначительноеповышение уровня транскриптов гена PsMT2, наблюдаемое при анализеклубеньков как линии дикого типа, так и мутантной линии, образованныхштаммами, не несущими данный ген, при выращивании растений в условияхкадмиевого стресса свидетельствует о незначительной роли этого гена вдетоксикациикадмиясосторонырастения-хозяина(Рисунок108).Значительное увеличение уровня экспрессии гена PsMT2 в клубеньках,образованных штаммом 3841-PsMT2 на корнях линии дикого типа имутантной линий в отсутствии кадмиевого стресса, свидетельствует о том,что наибольший вклад в уровень экспрессии, наблюдаемый при анализесимбиотических клубеньков, вносят именно ризобии, несущие данный ген.
Вто же время было показано, что высокая активность экспрессии гена PsMT2сохраняется и в условиях кадмиевого стресса (Рисунок 108).Результаты и обсуждение414относительный уровеньтранскриптов2,502,001,50контроль1,000,5 мкМ CdCl20,500,00SGE3841SGESGE SGECdt SGECdt SGECdt3841- 38413841 3841- 3841PsMT1 PsMT2PsMT1 PsMT2Рисунок 107. — Экспрессия гена PsМТ1 в клубеньках гороха,выращенных в гидропонике в условиях отсутствия CdCl2 и придобавлении 0,5 мкМ CdCl2относительный уровеньтранскриптов2,502,001,50контроль1,000,5 мкМ CdCl20,500,00SGE3841SGESGESGECdt SGECdt SGECdt3841- 38413841 3841- 3841PsMT1 PsMT2PsMT1 PsMT2Рисунок 108.
— Экспрессия гена PsМТ2 в клубеньках гороха,выращенных в гидропонике в условиях в условиях отсутствия CdCl2 ипри добавлении 0,5 мкМ CdCl2Использование для биоремедиации почв, загрязненных тяжелымиметаллами, симбиотических систем, таких, как бобовые растения иклубеньковые бактерии (ризобии), представляет большой интерес, посколькунаряду с извлечением тяжелых металлов такие системы позволяютРезультаты и обсуждение415обогащать почву питательными элементами (прежде всего азотом ифосфором) (Pajuelo et al., 2011; Ahmad et al., 2012; Mandal, Bhattacharyya,2012).В последние годы исследователями активно изучается возможностьиспользования бобовых культур и трансгенных штаммов микроорганизмовдля фиторемедиации, данное направление было названо «симбиотическойинженерией» (Sriprang, Murooka, 2007). Возникновение данного направлениясвязано с преимуществом использования клубеньковых бактерий посравнению с другими почвенными бактериями (Pajuelo et al., 2011).
Так,ризобии способны к быстрому росту: успешная инфекция одной бактериейможет привести к появлению 108 бактерий в симбиотическом клубеньке(Downie, 1997). Кадмий при этом накапливается в симбиотическихклубеньках. Первым удачным экспериментом было создание трансгенного(несущегогенчеловеческогометаллотионеинаMTL4)штаммаM. huakuii subsp. rengei, формирующего клубеньки с Astragalus sinicus(Sriprang et al., 2002).
Ген MTL4 был слит с промоторами генов nifH и nolB M.huakuii, что обеспечило его экспрессию, как в клетках клубеньковыхбактерий, так и в клубеньках при симбиозе с растением-хозяином. Прииспользовании полученного штамма в симбиозе с A. sinicus наблюдалось 6кратное увеличение аккумуляции кадмия в клубеньках (Sriprang et al., 2002).Было подсчитано, что один клубенек способен аккумулировать 1,4 нМ Cd,что при среднем количестве 100 клубеньков на растение составляет 140 нМна растение (Sriprang, Murooka, 2007).
Также был создан трансгенный штамм,несущий ген A. thaliana AtPCS, кодирующий фитохелатинсинтазу. При этомнаблюдалось9-19-кратноеувеличениесодержаниякадмияусвободноживущих ризобий и 1,5-кратное в симбиотических клубеньках(Sriprang et al., 2003).
Создание трансгенного штамма B3, несущего оба генаMTL4 и AtPCS, позволило еще больше увеличить содержание кадмия вклубеньках по сравнению с рекомбинантными штаммами, несущими толькоодин из указанных генов. Более того, данный штамм уже был успешноРезультаты и обсуждение416применен в целях фиторемедиации на рисовых полях, в результате чего за 2месяца выращивания из почвы было удалено 9% кадмия (Ike et al., 2007).Введение в штамм B3 гена A. thaliana AtIRT1, кодирующего переносчикметаллов, позволило еще больше увеличить поступление кадмия всимбиотические клубеньки (Ike et al., 2008).Следует заметить, что количество такого рода исследований крайнеограничено, что может быть связано с серьезными ограничениями,накладываемыми Евросоюзом на выпуск генетически модифицированныхмикроорганизмов в окружающую среду (Pajuelo et al., 2011).3.15.
Получение генетической модели для исследования влиянияплотных почв на развитие корневой системы и симбиотическихклубеньков у горохаОдним из серьезных абиотических стрессовых факторов, влияющих наразвитие растений, является уплотнение почв сельскохозяйственногоназначения в результате использования тяжелой сельскохозяйственнойтехники. Экономисты ставят данный фактор на третье место по значению вряду других факторов, приводящих к деградации сельскохозяйственныхугодий (Арбатов et al., 1999).
Для исследования влияния плотности почв наразвитие симбиотических клубеньков была поставлена задача полученияадекватной генетической модели.3.15.1. Скрининг мутантов с измененной чувствительностью кплотности субстратаДля этого был проведен скрининг растений популяции M3 линиидикого типа SGE, выращенных в кварцевом песке. Данный субстрат можетрассматриваться как субстрат повышенной плотности, хотя растения дикоготипа формируют в нем хорошо развитые корневые системы, на которыхформируются эффективные симбиотические клубеньки. Поэтому скринингпроводился с целью выявления растений, демонстрирующих отклонения вразвитии корневой системы, связанные с повышенной плотностью субстрата.Результаты и обсуждение417Популяция M3 была получена в результате проведенного ранее скринингамутантов по симбиотическим признакам у 285 семей M2.
В результатескрининга в одной из семей M3 было отобрано растение, формирующеетолстые сильно скрученные корни. Данный фенотип проявил стабильностьпроявления в двух последующих поколениях, мутант был обозначен какSGE93–20. Мутант SGE93–20 был скрещен с линией дикого типа SGE.Результаты реципрокных скрещиваний показали моногенное наследование ирецессивное проявление мутантного фенотипа (Таблица 40). Одно израстений F2 было использовано для селекции мутантной линии, названнойSGEcrt.3.15.2. Комплементационный анализБыли проведены тесты на аллелизм между мутантной линией SGEcrt идвумяранееописаннымимутантамигорохасморфологическиминарушениями корня: JI 2780 (lm) и NGB 5102 (age).
В результате былопоказано, что мутация линии SGEcrt не аллельна мутациям в генах lm и age.Таким образом, было показано, что мутантный фенотип «скрученные корни»определяется мутацией в ранее не идентифицированном гене, который былобозначен Pscrt («Pisum sativum curly roots»).Таблица 40. Анализ расщепления по фенотипу растений поколенийF1 и F2 от скрещиваний мутантной линии SGE93–20 и линии дикого типаSGEСкрещиванияРасщепление в F1Расщепление в F2ДикийтипСкрученныекорниДикийтипСкрученныекорни(3:1)SGE93–20 xSGE3038130,01SGE x SGE93–20402961,15Всего7067190,39χ2Результаты и обсуждение4183.15.3. Локализация локуса PscrtДля локализации нового локуса на генетической карте гороха линияSGEcrt была скрещена с множественно маркированной линией NGB1238.Были проанализированы две независимо полученные F2.
Анализ совместногонаследования морфологических маркеров и локуса Pscrt в первой популяциивыявил сцепление локуса Pscrt и маркера tl, локализованного в V группесцепления гороха. При анализе второй популяции была подтвержденалокализация локуса Pscrt в V группе сцепления гороха и выявлено егорасположение относительно маркеров tl, r и Sca (Таблица 41).3.15.4. Анализ проявления мутантного фенотипа в зависимости отплотности субстратаПри размножении мутантных растений в сосудах, содержащих вкачестве субстрата вермикулит, было замечено, что растения мутантнойлинии формируют корневые системы сходные по морфологии с исходнойлинией. Для того, чтобы изучить зависимость проявления мутантногофенотипа от плотности субстрата растения были выращены как в кварцевомпеске (субстрат высокой плотности), так и вермикулите (субстрат низкойплотности). В кварцевом песке мутантные растения формировали оченьнебольшую компактную корневую систему, по сравнению с линией дикоготипа SGE (Рисунок 109А, Таблица 42), также у мутанта была снижена длинамеждоузлий побега.
В вермикулите различия между фенотипами корневыхсистем мутанта и исходной линии были выражены значительно слабее(Рисунок 109Б, Таблица 42), в то время как мутант и исходная линия неразличались по длине стебля. Было показано, что мутант и исходная линияразличались по развитию корневых систем при росте на среде MSO сплотностью агара 0,8% (Рисунок 109В, Г).Таблица 41. Анализ расщепления по фенотипу растений поколений F1 и F2 от скрещиваний мутантнойлинии SCEcrt (crt) x NGB1238 (r, tl, Sca)парагеновКоличество потомков с обозначеннымфенотипом*A/B A/h A/b h/B h/h H/b a/B a/hВсегоСцепление,Объединенный χ2P(9:3:3:1)сM ± ст.a/bошибкаPscrt–r419914153619611,13±2,41102,060,0001Pscrt–tl3910015153619611,59±2,4199,040,0001Pscrt–Sca 4287252132719623,48±3,4040,390,0001* A,a — первый ген, B,b — второй ген, H — гетерозигота.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
