Диссертация (1144724), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Это с одной стороны позволяет представить себе генетическуюпрограмму симбиогенеза как часть общих генетических программ развитиярастения, а с другой — значительно усложняет наши представления овозможностях селекции по данному признаку, а также о возможностиконструирования новых симбиотических систем на небовых растениях.В данной работе было значительно уточнено строение района IIIгруппы сцепления гороха, содержащего симбиотический ген Pssym31 иопределено его точное расположение относительно 8 молекулярных и 3морфологических маркеров, также позиционированных в этом районе.Данные результаты будут использованы для проведения дальнейшихисследований по точной локализации данного гена и создания условий дляего клонирования.
Проведенная первичная локализация симбиотическоголокуса Pssym38 в V группе сцепления гороха открывает возможности дляпроведения дальнейшей его точной локализации. Также с использованиемморфологических и молекулярных маркеров была проведена первичнаялокализация симбиотического локуса Pssym33 в I группе сцепления гороха.Это позволило в дальнейшем (вне рамок данной работы) выявитьпотенциальный ортолог данного гена в геноме M. truncatula и провестиклонирование Pssym33 гена (Ovchinnikova et al., 2011).Детальный анализ развития клубеньков у серии мутантов гороха,блокированныхнараннихстадияхразвитиясимбиоза,позволилпредположить существование двух генетических подпрограмм развитиясимбиотического клубенька: инфекции тканей симбиотического клубенька иорганогенеза клубенька.
При этом были выявлены точки взаимного контроляреализации данных подпрограмм. Так, нами было выявлено три точки дляЗаключение434инфекции тканей симбиотического клубенька и одна точка для органогенезаклубенька. У мутантов по генам Pssym2, Pssym36, Pssym37 и Pssym38развитие тканей клубенька абортируется после развития клубеньковогопримордия и перед развитием меристемы клубенька. У мутанта Mtlinнаблюдается схожий фенотип (Kuppusamy et al., 2004).
Трансформация 3-хнезависимых мутантов по гену Mtlin конструкцией, содержащей MtDMI31−311,экспрессия которой вызывает автоактивацию MtCCaMK, приводила кформированию клубеньков. Это позволяет предположить, что Mtlin неявляется необходимым для органогенеза клубенька, а контролирует развитиеинфекции.
То есть, уровень органогенеза клубенька определяется степеньюпродвинутости ризобиальной инфекции (Kiss et al., 2009). Таким образом,наши предположения, построенные на формальной логике генетическогоанализа, были подтверждены с использованием молекулярно-генетическихисследований.Проведенный детальныйанализ фенотипическихпроявленийуизученных мутантов позволил выявить наиболее вероятного кандидата нароль ортолога гена LjNIN — первого клонированного симбиотического генабобовых растений (Schauser et al., 1999).
Таким кандидатом оказался генPssym35, независимые мутанты по этому гену характеризовались сильноувеличенным количеством скрученных корневых волосков по сравнению сдикимтипом.Картированиеданноголокусаподтвердилоданноепредположение. Анализ геномной синтении между горохом и L. japonicusпозволил клонировать ген Pssym35. Его клонирование позволило создатьметодологию использования достижений генетики модельных бобовых длявыявления симбиотических генов культур, важных для сельского хозяйства.В ее основе лежит детальная фенотипическая характеристика мутантов уважнойдлясельскогохозяйствабобовойкультуры,картированиесимбиотического гена интереса на генетической карте и анализ синтении имикросинтении с модельным бобовым растением для его клонирования. ВЗаключение435настоящее время клонирование симбиотических генов на основе геномнойсинтении превратилось в рутинную процедуру.Длявыявлениясимбиотическихклеточныхклубеньковмеханизмовбылидифференцировкиизучены:распределениеарабиногалактанпротеин-экстензинов и пероксида водорода, реорганизациятубулинового цитоскелета, влияние этилена и нитратов.Входепроведенияанализараспределенияарабиногалактанпротеин-экстензинов в клубеньках гороха для мутантаSGEFix−-1 (Pssym40) наблюдалось изменение их направленной секреции.Везикулы, несущие арабиногалактанпротеин-экстензины, отклонялись всторону межклеточного матрикса, а не в сторону просвета инфекционныхнитей.Полученныенаправленнойрезультатысекрециипоказываютважностьарабиногалактанпротеин-экстензиновмеханизмавпросветинфекционной нити для ее нормального функционирования.Распределение пероксида водорода было изучено в клубеньках горохадикого типа, а также трех мутантов, формирующих неэффективныеклубеньки с ярко выраженными защитными реакциями.
В клубеньках горохадикого типа пероксид водорода был ассоциирован с матриксом и стенкамиинфекционных нитей, а также клеточными стенками, принимая участие в ихсозревании, но не наблюдался в симбиосомах. В то же время в стареющихклубенькахнаблюдаласьдеградирующихаккумуляциябактероидов.пероксидаАналогичноеводородараспределениевокругпероксидаводорода наблюдалось ранее в клубеньках люцерны, гороха и сои (Santos etal., 2001; Rubio et al., 2004; Kopcińska, 2009). Отсутствие пероксида водородав симбиосомах может быть связано с антиоксидантной системой, активнофункционирующей как в инфицированной клетке, так и в симбиосомах(Becana et al., 2010; Ribeiro et al., 2015).
В то же время у всехпроанализированных мутантов наблюдались аномалии в локализациипероксида водорода, что, вероятно, связано с активацией в этих мутантахЗаключение436сильных защитных реакций (Ivanova et al., 2015). Ранее отложение пероксидаводорода вокруг бактероидов было показано при обработке клубеньковразличными тяжелыми металлами (Górska-Czekaj, Borucki, 2013).
Такимобразом, пероксид водорода не только принимает участие в защитныхреакциях, но и является необходимым компонентом при созреванииинфекционных нитей в ходе дифференцировки клубенька.Организация тубулинового цитоскелета в клубеньках M. truncatula(Timmers et al., 1998) и гороха (Davidson, Newcomb, 2001) исследоваласьранее, но с ограниченным описанием тубулинового цитоскелета. В данномисследовании представлена трехмерная структура тубулинового цитоскелетаи симбиотических структур в различных типах клеток в клубеньках M.truncatulaигороха.эндоплазматическихВрезультатемикротрубочекбылаввыявленаростеиведущаярольфункционированииинфекционных нитей и капель.
Наблюдаемое сходство в организацииэндоплазматическихмикротрубочеквокругинфекционныхкапельиарбускул позволяет предположить возможную гомологию между этимидвумя инфекционными структурами. Несколько линий доказательствсоотносятся с идеей об общей генетической программе, которая вначалеэволюционировала при развитии арбускулярно-микоризного симбиоза, азатем была использована в эволюции для бобово-ризобиального симбиоза(Parniske, 2008). Прежде основное внимание уделялось ранним стадиямсимбиотических взаимодействий, на которых несколько генов необходимыдля обоих симбиозов. Значительно позднее сходство было замечено напоздних стадиях, когда было показано, что экзоцитоз, а не эндоцитоз, какполагалось ранее, играет ведущую роль в выходе бактерий из инфекционныхкапель и во время развития арбускул (Ivanov et al., 2010).
Ранее былозамечено сходство между формированием симбиосом у Parasponia (небобового растения, способного формировать клубеньки) и формированиемарбускул (Lancelle, Torrey, 1985), а недавно было показано, что у гороха и M.truncatula модуль MtDMI3–MtIPD3 необходим для внутриклеточногоЗаключение437размещения как ризобий, так и арбускулярных грибов (Ovchinnikova et al.,2011). С эволюционной точки зрения это может означать, что бобовыерастения расширили свои симбиотические взаимодействия с ризобиями,используя программу развития микоризы от раннего этапа восприятиямикросимбионта до этапа его размещения в клетке.
В соответствии с этойидеей, недетерминированный тип инфекции, существующий во всехактиноризных симбиозах, и в нескольких бобово-ризобиальных симбиозах,когда бактерии не высвобождаются из инфекционных нитей, а остаются вветвящихся инфекционных нитях, заполняющих инфицированные клетки(Gualtieri, Bisseling, 2000; Pawlowski, Demchenko, 2012), весьма напоминаетситуацию во время формирования арбускул.При исследовании организации кортикальных микротрубочек былопоказано,что,поколонизированныхмереклетокдифференцировки(вкоторыхнеинфицированныхприсутствуютиинфекционныеструктуры — инфекционные нити и капли, но не происходит выходбактерий), они образуют паттерн, характерный для клеток корня изпереходной зоны: расположенные поперечно относительно продольной осиклетки пучки (Adamakis et al., 2010). В то же время при выходе бактерийданный паттерн изменяется на неупорядоченный, что, вероятно, являетсянеобходимымусловиемдляпоследующегоувеличенияразмеровинфицированной клетки в ходе дифференцировки.Важно отметить, что паттерны эндоплазматических микротрубочеквокруг симбиосом в клубеньках гороха и M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
