Диссертация (1144724), страница 65
Текст из файла (страница 65)
truncatula различались, чтоотражает разницу в структуре симбиосом.M. truncatula используется более 20-ти лет в биологии бобовыхрастений как модельное растение, формирующее недетерминированныеклубеньки (Barker et al., 1990). Многие достижения, прежде всего вмолекулярной генетике, были перенесены от M. truncatula на другие видыбобовых растений, например, горох (Dolgikh et al., 2011). В данномЗаключениеисследовании,438направленномнаанализорганизациитубулиновогоцитоскелета во время развития клубеньков у M. truncatula и гороха, быливыявленыопределенныеразличиямеждудвумявидами.Поэтомупредставляется, что развиваемое нами новое направление исследований —сравнительная клеточная биология бобовых растений позволит выявить какобщиеклеточныемеханизмы,лежащиевосновеклеточнойдифференцировки во время развития клубенька, так и характерныевидоспецифичные особенности, что должно привести к пониманию ихбиологического значения.Дифференцировкасимбиотическогоклубенькаконтролируетсяразличными фитогормонами, в том числе этиленом (см.
раздел 1.1.15). Вданном исследовании были получены новые доказательства, что этиленконтролирует развитие клубеньков на различных стадиях: при ростеинфекционной нити в коре корня, а также при формировании клубеньковоймеристемы, что было показано при выявлении нового этиленчувствительногомутанта по гену Pssym12. Более того, было выявлено, что этилен, вероятно,контролирует и функционирование меристемы в зрелом клубеньке. Ранеебыло показано, что в апикальной меристеме корня этилен способствуетсдвигу от митотического цикла к эндоредупликации, что приводит кограничению пролиферации клеток (Street et al., 2015). Возможно, что вклубеньках этилен выполняет сходную функцию, обеспечивая переходклеток, покидающих меристему, к эндоредупликации в зоне инфекции.В ходе проведенных исследований с использованием L.
japonicus,образующего детерминированные клубеньки и гороха, формирующегонедетерминированные клубеньки, было выявлено, что ряд мутаций,приводящих к неэффективному симбиозу, влияет на ингибирующий эффектнитратов на клубенькообразование. Особенно примечательным являетсяописаниемутацииPssym31,котораяприводиткнарушениямдифференцировки бактероидов. Это может указывать на существованиеЗаключение439связи между дифференцировкой бактероидов и нитратным ингибированиемклубенькообразования.Качественный и количественный анализ экспрессии бактериальныхгенов, связанных и не связанных с симбиозом, показал, что их экспрессияпостепенно уменьшается в ходе реализации программы дифференцировкибактероидов,заисключениемсимбиотическихгенов,регулируемыхкислородом. Этот процесс происходит параллельно с постепеннымиморфологическими изменениями, наблюдаемыми в бактериальных клетках.Даже активно репрессируемые гены, такие как индуцируемые флавоноидамиnod гены, как представляется, также подвергаются процессу постепенногоснижения их экспрессии во время развития бактероидов.
Было высказанопредположение, что nod гены репрессируются сразу после выхода бактерийиз инфекционных капель. Однако наши результаты указывают, что активнаярепрессия зависит от степени достигнутой дифференцировки, и чтонаибольшая репрессия достигается только в азотфиксирующих бактероидах.Также активно индуцируемые гены, такие как dctA, по-видимому,подвергаются общему снижению экспрессии генов.
Регуляция dctA вклубеньках является комплексной (Mavridou et al., 1995; Boesten et al., 1998).Индукция dctA внутри клубенька может регулироваться не зависящим отстадии дифференцировки бактероидов, но зависимым от кислорода типомрегуляции, связывая поглощение дикарбоновых кислот и продукцию энергиис регулируемым кислородом процессом азотфиксации.Наши данные согласуются с предыдущими исследованиями, в которыхбыло предположено, что развитие органелло-подобных азотфиксирующихсимбиосом после выхода бактерий из инфекционных нитей не являетсяпростым следствием этого выхода, а представляет собой постепенныйпроцесс, состоящий из нескольких дополнительных стадий, каждая изкоторых контролируется различными генами растений (Vasse et al., 1990).
Впоследние годы на роль таких регуляторов были предложены NCR пептиды(Tsyganova et al., 2018). Постепенное снижение экспрессии генов вЗаключение440бактероидах происходит параллельно с различными морфологическимистадиями, наблюдаемыми в недетерминированных клубеньках. Учитываяэто, можно сказать, что процесс дифференцировки бактероидов напоминаетрегулируемый процесс адаптации к среде внутри симбиосомы, котораяявляется стрессовой для бактероидов (Brewin et al., 1988; Santos et al., 2000).Конечным результатом этого адаптивного процесса будет зрелый, активноазотфиксирующий бактероид, который подвергся потере биологическойидентичности (переход к органелло-подобному состоянию), как следствиепотери способности возобновить свободноживущий рост (Tsyganova et al.,2018).В данной работе было продемонстрировано, что единичные мутации вгенах гороха, контролирующие поздние стадии развития симбиоза, приводятк индукции специфических защитных реакций, имеющих различныепроявления (суберинизация, отложение каллозы, индукция генов защитногоответа).
Таким образом, полезные бактерии в ходе неэффективногосимбиогенеза воспринимаются как патогены. Это свидетельствует, чторастениестрогоконтролируетмикросимбионтавтечениевсегосуществования клубенька. Из этого следует, что попытки биотехнологоврасширить ряд азотфиксирующих растений за счет не бобовых культур(Oldroyd, Dixon, 2014) столкнутся с большими трудностями.Нами было показано, что гены, ассоциированные со старением,активируются в клубеньках мутантов, у которых развитие клубеньковблокированонаразличныхстадиях.Ранеебылавыявленагруппарастительных и бактериальных мутантов, формирующих неэффективныеклубеньки на корнях M. truncatula, претерпевающих раннее старение врезультате своей неэффективности (Maunoury et al., 2010).
Тем не менее,развитие клубеньков у этих мутантов блокировано на продвинутых стадиях,сходных с таковыми у мутантов гороха по генам Pssym26 и Pssym27.Принимая во внимание, что в ходе данной работы мы наблюдали активациюраннего старения у мутантов, дефектных по генам Pssym33, Pssym40,Заключение441Pssym26, Pssym27, а ранее у мутантов по генам Pssym13 и Pssym31 (Serova etal., 2017), можно предположить, что раннее старение является общимфеноменом в ответ на неэффективность клубенька. При этом оно неограничиваетсямутантамибобовыхрастений,которыеформируютклубеньки с морфологически дифференцированными симбиосомами, нолишены способности фиксировать азот.
Ранее во время формированияклубеньков после инокуляции неэффективным ризобиальным штаммом былиописаны «санкции» со стороны растения, которые приводили к ограничениюразмера клубенька (Oono et al., 2011; Regus et al., 2017; Westhoek et al., 2017).Часто «санкции» сопровождаются старением клубенька (Regus et al., 2017).Принимая во внимание эти результаты, можно предположить, что старениеявляется универсальным механизмом для реутилизации питательныхвеществ, находящихся в неэффективных клубеньках, подобно тому, как этопроисходит при нормальном старении клубеньков (Van de Velde et al., 2006;Pérez Guerra et al., 2010).Кадмий является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов,который легко распространяется по пищевым цепям.
Было показано, чтокадмий влияет не только на развитие самих растений, но и оказываетнегативный эффект на развитие и функционирование симбиотическихклубеньков. Тем не менее, количество таких исследований очень ограничено(Кулаева, Цыганов, 2010). В данной работе был получен уникальный мутантгороха SGECdt, характеризующийся как повышенной устойчивостью кхлориду кадмия, так и увеличенным его накоплением в тканях растения(Tsyganov et al., 2007). Для A. thaliana мутанты, совмещающие оба признака,были получены позднее (Watanabe et al., 2010).
Точная локализация мутацииcdt создает условия для позиционного клонирования гена Сdt. Проведенныйанализ влияния мутации на развитие бобово-ризобиального симбиозавыявил,чтокакпроцессформированияклубеньков,такиихфункционирование также характеризуются повышенной устойчивостью ккадмию, по сравнению с диким типом. Использование данной мутацииЗаключение442может быть перспективным направлением при создании растительномикробных систем с целью фиторемедиации почв, загрязненных тяжелымиметаллами.В данной работе методами генной инженерии созданы два штаммаклубеньковых бактерий гороха (3841-PsMT1 и 3841-PsMT1), содержащиекодирующие области растительных генов PsMT1 и PsMT2, слитые спромоторной областью ризобиального гена nifH.
Данные штаммы былииспользованы для инокуляции гороха линии дикого типа SGE, а такжеустойчивой к кадмию мутантной линии SGECdt. Было показано, что вформируемыхиспользованнымиштаммамиклубенькахактивноэкспрессируются гены PsMT1 и PsMT2. При этом трансгенные штаммыувеличивали содержание кадмия как в корнях и клубеньках, так и в стебляхрастений гороха. Таким образом, полученные трансгенные штаммы 3841PsMT1 и 3841-PsMT1 являются перспективными для использования врастительно-микробной системе (кадмий-устойчивый мутант гороха SGECdt— штаммы 3841-PsMT1 и 3841-PsMT1), которая может быть использованапри создании технологий «симбиотической инженерии» для фиторемедиациипочв, загрязненных кадмием.
Следует отметить, что при инокуляциисозданными трансгенными штаммами была выявлена стимуляция ростарастений (увеличение биомассы растений в 1,5 раза), причем у мутанта этастимуляция проявлялась и в условиях кадмиевого стресса. Даннаястимуляция может объясняться оптимизацией гомеостаза ряда элементов(прежде всего цинка и меди) в результате повышения в растениях уровняметаллотионеинов, однако для подтверждения этой гипотезы необходимопроведение дальнейших экспериментов.Несмотря на то, что были получены большие коллекции мутантов снарушениями в развитии корня (Scheres, Wolkenfelt, 1998), только некоторыеиз них вызывают нарушения в организации цитоскелета (Kost et al., 1999).Например, мутанты A.thaliana fass/tonneau характеризуются изменениямиуровней ауксина и этилена (Fisher et al., 1996), приводящими к дефектномуЗаключение443росту органов, связанному с отсутствием препрофазных поясков ирегулярной организации кортикальных микротрубочек в клетке растения(Traas et al., 1995).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
