Диссертация (1144724), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Данные фрагменты были выделены из геля ииспользованы для дальнейших манипуляций.3.14.2 Клонирование генетических конструкций nifH-PsMT1 и nifHPsMТ2всоставевектораpAL-TAианализихнуклеотидныхпоследовательностейПолученныеконструкцииnifH-PsMT1иnifH-PsMT2быликлонированы в составе Т-вектора pAL-TA. Из полученных трансформантовE. coli DH5α были отобраны клоны, содержащие плазмиду со вставкой встрого определенной ориентации (промоторная часть гена nifH примыкает кполилинкеру, содержащему место отжига для праймера М13-for, акодирующие области генов PsМТ1 и PsМТ2 — М13-rev). Такая ориентациявставки была необходима для проведения дальнейшей рестрикции сиспользованием ферментов BamHI и PstI. Сайт рестрикции фермента BamHIбыл введен нами в последовательность праймера nifH-FOR, а сайтрестрикции PstI находился в составе полилинкера вектора pAL-TA со стороныпраймера М13-rev.
Ориентацию вставок nifH-PsMT1 и nifH-PsMT2 в вектореpAL-TA определяли методом ПЦР с использованием пары праймеров nifHFOR М13-REV.ОтобранныеПЦР-фрагментыбыливыделеныизгелядлясеквенирования с целью анализа точности слияния фрагментов. В общейсложности было проанилизировано 42 фрагмента. Это позволило отобратьдва фрагмента, содержащих конструкции nifH-PsMT1 и nifH-PsMT2 снеповрежденными промоторными участками и кодирующими областями.Результаты и обсуждение4073.14.3 Клонирование конструкций nifH-PsMT1 и nifH-PsMТ2 всоставе вектора pCAMBIA0390 и введение их в типовой штаммклубеньковых бактерий R.
leguminosarum bv. viceae 3841Из отобранных на предыдущем этапе клонов E. coli DH5α быливыделены плазмиды pAL-TA с интересующими вставками и последовательнорестрицированы ферментами PstI и BamHI.Полученные в ходе обработки рестриктазами фрагменты nifH-PsMT1(1018 пн) и nifH-PsMT2 (1014 пн) были выделены из геля и клонированы всоставе вектора pCAMBIA, способном к репликации в клетках клубеньковыхбактерий. Полученные плазмиды были перенесены в мобилизующий штаммS17 E. сoli методом трансформации.На последнем этапе полученные плазмиды методом конъюгации былиперенесены в штамм 3841 клубеньковых бактерий гороха (R leguminosarumbv.viceae).генетическихНаличиевконструкцийотобранныхбылотрансконъюгантахподтвержденометодомсозданныхПЦРсиспользованием праймеров nifH-FOR и MT1-REV (для слияния nifH-PsMT1),nifH-FOR и MT2-REV (для слияния nifH-PsMT2).Таким образом, было получено два трансгенных штамма 3841-PsMT1 и3841-PsMT2 клубеньковых бактерий R.
leguminosarum bv. viceae 3841,содержащих гены растительных металлотионеинов PsMT1 и PsMT2 подконтролем ризобиального промотора nifH.3.14.4 Анализпроцентасохраненияплазмидутрансгенныхштаммов и влияния хлорида кадмия на наследование pCAMBIA-nifHPsMT2Была проведена оценка стабильности генетических конструкций вполученных трансгенных штаммах 3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 как всвободноживущем состоянии, так и в симбиотических клубеньках. Изклубеньков гороха были выделены ризобии, и было проанализированонаследованиеплазмидpCAMBIA-nifH-PsMT1иpCAMBIA-nifH-PsMT2Результаты и обсуждение408соответственно. Для этого проводился параллельный посев выделенныхколонийризобийнапитательнуюсреду,содержащуюантибиотикстрептомицин, к которому устойчив исходный штамм, и среду, содержащуюстрептомицин и селективный антибиотик канамицин.
По разнице в ростеколонийнасредаханализировалсяПолученныеданныесвидетельствуютклубеньковымибактериямипроцентплазмидыонаследованиястопроцентномpCAMBIAсплазмид.сохраненииинтересующимивставками как в клубеньках гороха линии дикого типа SGE, так и вклубеньках гороха мутантной линии SGECdt в условиях отсутствиякадмиевого стресса.ДляплазмидыpCAMBIA-nifH-PsMT2былопровереновлияниекадмиевого стресса на ее сохранение. Для этого были использованыклубеньки, выращенные в песке, загрязненном 10 мкМ CdCl2. Полученныеданные свидетельствуют о снижении процента сохранения ризобиямиплазмиды pCAMBIA с интересующей вставкой как в клубеньках горохалинии SGE, так и в клубеньках линии SGECdt при концентрации хлоридакадмия 10 мг/кг.
Потерю плазмиды при концентрации хлорида кадмия10 мг/кг можно объяснить компактизацией генома бактерий при развитиистресса (Sriprang et al., 2002).Для подтверждения отсутствия плазмиды у клонов, выросших на средесо стрептомицином, но не выросших на среде с двумя антибиотиками —стрептомициномиканамицином,былпроведенПЦРанализ.Винтересующих клонах проверили наличие конструкции nifH-PsMT2 методомстандартной ПЦР с использованием прямого праймера к промотору nifH иобратного праймера к кДНК гена PsMT2.
В результате было показаноотсутствие конструкции в исследуемых клонах, что подтверждает потерюплазмиды трансгенным штаммом при повышенной концентрации хлоридакадмия.Результаты и обсуждение4093.14.5 Анализ влияния хлорида кадмия на биомассу растенийгороха, инокулированных трансгенными штаммами R. leguminosarum3841-PsMT1 и 3841-PsMT2Был проведен анализ влияния трансгенных штаммов на биомассупобегов и корней. При этом было показано, увеличение сухого веса корней в1,5 раза как у растений линии дикого типа SGE, так и мутантной линииSGECdt, инокулированных как трансгенным штаммом 3841-PsMT1, так и3841-PsMT2 по сравнению с вариантом инокуляции исходным штаммом3841 (Рисунок 103). При этом следует отметить, что обработка 0,5 мкМ CdCl2не влияла на этот параметр.
Также наблюдалось увеличение сухого весапобегов в вариантах инокуляции трансгенными штаммами по сравнению свариантом с инокуляцией исходным штаммом (Рисунок 104). Однако придобавлении 0,5 мкМ CdCl2 увеличения сухого веса побегов у линии дикоготипа при инокуляции трансгенными штаммами не наблюдалось, в то времякак у мутантной линии прибавка сухого веса сохранялась (Рисунок 104).Известно, что помимо секвестирования токсичных для растений тяжелыхметаллов, металлотионеины выполняют функцию поддержки гомеостазанекоторых необходимых для растений металлов, таких как цинк и медь.Очевидно, что инокуляция растений трансгенными штаммами 3841-PsMT1 и3841-PsMT2 приводила к увеличению содержания металлотионеинов врастениях,что,вероятно,способствовалооптимизациигомеостазанеобходимых металлов и способствовало, в конечном итоге, увеличениюбиомассы растений.масса, мгРезультаты и обсуждение4109080706050403020100контроль0,5 мкМ CdCl2SGE3841SGESGE38413841PsMT1 PsMT2SGECdt SGECdt SGECdt384138413841PsMT1 PsMT2Рисунок 103.
— . Сухой вес корней с клубеньками при инокуляциилинии гороха дикого типа SGE и мутанта SGECdt исходным штаммомR leguminosarum bv. viceae 3841 и трансгенными штаммами 3841-PsMT1и 3841-PsMT2 в условиях отсутствия CdCl2 и при добавлении 0,5 мкМCdCl2350300масса, мг250200150контроль1000,5 мкМ CdCl2500SGE3841SGE3841PsMT1SGE3841PsMT2SGECdt SGECdt SGECdt384138413841PsMT1 PsMT2Рисунок 104. — Сухой вес стеблей при инокуляции линии гороха дикоготипа SGE и мутанта SGECdt исходным штаммом R.
leguminosarum bv.viceae 3841 и трансгенными штаммами 3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 вусловиях отсутствия CdCl2 и при добавлении 0,5 мкМ CdCl2Результаты и обсуждение3.14.6 Анализсодержания411кадмияврастенияхгороха,инокулированных трансгенными штаммами R. leguminosarum 3841PsMT1 и 3841-PsMT2Анализ содержания кадмия в корнях и клубеньках показал, чтомутантная линия SGECdt накапливает в 1,5 раза больше кадмия посравнению с линией дикого типа SGE при инокуляции исходным штаммом3841 (Рисунок 105). Инокуляция трансгенными штаммами 3841-PsMT1 и3841-PsMT2 приводила к значительному увеличению накопления кадмия вкорнях и клубеньках растений исходной линии SGE по сравнению свариантом с инокуляцией исходным штаммом 3841 (в случае штамма 3841PsMT2 на 80%).
Эти значения превышают содержание кадмия у мутантнойлинии SGECdt, инокулированной исходным штаммом (Рисунок 105).Инокуляция трансгенными штаммами 3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 приводилак увеличению содержания кадмия в корнях и клубеньках мутантной линииSGECdt по сравнению с вариантом с инокуляцией исходным штаммом 3841,но это увеличение менее выражено, чем у линии дикого типа (Рисунок 105).Анализ содержания кадмия в стеблях показал, что мутантная линияSGECdt накапливала на 40% больше кадмия по сравнению с исходной линиейSGE при инокуляции исходным штаммом 3841 (Рисунок 106). Инокуляциятрансгеннымиштаммами3841-PsMT1и3841-PsMT2приводилакувеличению накопления кадмия в стеблях линии дикого типа SGE посравнению с вариантом с инокуляцией исходным штаммом 3841 (в случаештамма 3841-PsMT1 в 2 раза) (Рисунок 106). Для мутантной линии SGECdtувеличение содержания кадмия наблюдалось лишь для штамма 3841-PsMT2(Рисунок 106).содержание Cd, ppmРезультаты и обсуждение10009008007006005004003002001000SGE3841SGE3841PsMT1412SGE3841PsMT2SGECdt3841SGECdt3841PsMT1SGECdt3841PsMT2содержание Cd, ppmРисунок 105.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
