Диссертация (1144724), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Уровень транскриптов PsACS2 взоне III′ мутантных клубеньков был в 31,8 раза выше, чем в зоне IIIклубеньков дикого типа (Рисунок 81Д).Рисунок 78. — Лазерная микродиссекция и катапультированиеинфицированных клеток из 2-недельных клубеньков линии дикого типаSGE(А) Гистологическая организация клубенька. (Б) инфицированныеклетки из зоны III перед катапультированием (В), инфицированные клетки иззоны III после катапультирования, (Г) изолированные клетки. I — меристема,II — зона инфекции, III — зона азотфиксации; стрелки указывают навырезанные области. Масштабная линейка (А) = 150 мкм, (В-Г) = 75 мкм.Результаты и обсуждение362Рисунок 79. — Лазерная микродиссекция и катапультированиеинфицированных клеток из 4-недельных клубеньков линии дикого типаSGE(А) Гистологическая организация клубенька.
Инфицированные клеткииз зоны III (Б) и зоны IV (Д) перед катапультированием, инфицированные иззоны III (В) и зоны IV (Е) после катапультирования, (Г, Ж) изолированныеклетки. I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, IV —зона старения, стрелки указывают на вырезанные области. Масштабнаялинейка (А) = 150 мкм, (В-Ж) = 75 мкм.Во время старения клубеньков уровни транскриптов PsACO1,кодирующего фермент биосинтеза этилена, были увеличены в клубенькахдикого типа и мутанта.
У дикого типа транскрипты PsACO1 детектировалисьтолько в 4-недельных клубеньках. В клубеньках дикого типа уровеньтранскриптов PsACO1 не различался достоверно между зонами IV и IIIРезультаты и обсуждение363(Рисунок 81Е). В мутантных клубеньках уровень транскриптов PsACO1 былв 7,5 раза выше в зоне IV, чем в зоне III′. Наибольшее увеличение (в 13.7раза) уровня транскриптов PsACO1 наблюдалось в зоне III′ клубеньковмутанта по сравнению с зоной III клубеньков дикого типа (Рисунок 81Е).Рисунок 80.
— Лазерная микродиссекция и катапультированиеинфицированных клеток из 2-недельных клубеньков мутантной линииSGEFix−-7 (Pssym27)(А) Гистологическая организация клубенька. Инфицированные клеткииз зоны III’ (Б) и зоны IV (Д) перед катапультированием, инфицированныеклетки из зоны III’ (В) и зоны IV (Е) после катапультирования, (Г, Ж)изолированные клетки. I — меристема, II — зона инфекции, III’ — зона,соответствующая зоне азотфиксации в клубеньках дикого типа, IV — зонастарения, стрелки указывают на вырезанные области. Масштабная линейка(А) = 150 мкм, (В-Ж) = 75 мкм.Результаты и обсуждение364Рисунок 81. — Относительный уровень транскриптов PsCyp15a, PsTPP,PsATB2, PsAO3, PsACS2 и PsACO1 в инфицированных клетках из зон III(III*) и IV клубеньков гороха линии дикого типа SGE и мутантнойлинии SGEFix−-7 (sym27) через 2 и 4 НПИБуквы (a, b, c) указывают достоверные различия (P≤0,05): a — от 2недельных клубеньков линии дикого типа SGE (зона III); b — между зонамиIII и IV в 4-недельных клубеньках линии дикого типа SGE; c — междуРезультаты и обсуждение365зонами III* и IV в 2-недельных клубеньках линии SGEFix−-7 (Pssym27).Разрыв в графике указывает изменения в шкале.
зона III* — зона,соответствущпя зоне азотфиксации в клубеньках дикого типа.3.12.4. Иммунолокализация АЦК в клубеньках дикого типа SGE имутантахДля подтверждения наблюдаемого увеличения уровней экспрессиигенов биосинтеза этилена была проведена иммунолокализация АЦК на 10-йДПИ (Рисунок 82, Рисунок 83), 2 (Рисунок 84), 4 и 6 НПИ (Рисунок 85).
Вклубеньках дикого типа интенсивность флуоресцентного сигнала АЦКувеличивалась с увеличением возраста клубеньков (Рисунок 82А-В, Рисунок84А-В, Рисунок 85А-Е). В клубеньках всех проанализированных мутантовуровни АЦК достигали максимума к 10-му ДПИ и были значительно выше,чем в клубеньках дикого типа (Рисунок 82Г-П, Рисунок 83Г-П). В 4недельных клубеньках интенсивность мечения АЦК была значительно нижев клубеньках мутантов, по сравнению с клубеньками дикого типа.Интенсивность мечения АЦК в 2-недельных клубеньках мутантов SGEFix−-3(Pssym26) (Рисунок 82К–М, Рисунок 83К–М) и SGEFix−-7 (Pssym27)(Рисунок 82Н–П, Рисунок 83Н–П) была выше, чем у мутантов SGEFix−-1(Pssym40) (Рисунок 82Г–Е, Рисунок 83Г–Е) и SGEFix−-2 (Pssym33) (Рисунок82Ж–И, Рисунок 83Ж–И).В 10-дневных клубеньках дикого типа максимум сигнала АЦКнаблюдался в клетках меристемы и клетках зоны инфекции (Рисунок 82А-В),в то время как более слабый сигнал АЦК наблюдался в клетках из зоныазотификсации (Рисунок 83А–В).
В клубеньках мутантов SGEFix−-1(Pssym40) (Рисунок 82Г-Е), SGEFix−-2 (Pssym33) (Рисунок 82Ж-И), SGEFix−3 (Pssym26) (Рисунок 82К–М) и SGEFix−-7 (Pssym27) (Рисунок 82Н–П)максимальнаяинтенсивностьсигналаАЦКнаблюдаласьвмеристематических клетках, зоне инфекции и зоне, соответствующей зонеазотфиксации в клубеньках дикого типа (Рисунок 83Г–П).Результаты и обсуждение366Рисунок 82. — Иммунолокализация АЦК в 10-дневных клубенькахгороха линии дикого типа SGE (А-В) и мутантах (SGEFix−-1 (Pssym40)(Г–Е), SGEFix−-2 (Pssym33) (Ж–И), SGEFix−-3 (Pssym26) (К–М), andSGEFix−-7 (Pssym27) (Н–П))I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, III’ —зона, соответствующая зоне азотфиксации в клубеньках дикого типа.Тепловая карта интенсивности флуоресцентного сигнала зеленого канала(синий цвет соответствует минимальной интенсивности сигнала, красный —максимальной) (В, Е, И, М, П). Наложение дифференциальногоинтерференционного контраста и красного канала (А, Г, Ж, К, Н), наложениезеленого и красного каналов (Б, Д, З, Л, О).
Зеленый канал — АЦК, красный— ядра и бактерии. Масштабная линейка = 100 мкм.Результаты и обсуждение367Рисунок 83. — Иммунолокализация АЦК в клетках в центральной части10-дневных клубенков гороха линии дикого типа SGE (А-В) и мутантах(SGEFix−-1 (Pssym40) (Г–Е), SGEFix−-2 (Pssym33) (Ж–И), SGEFix−-3(Pssym26) (К–М), and SGEFix−-7 (Pssym27) (Н–П))ик — инфицированная клетка, ник — неинфицированная клетка,стрелки указывают на инфекционные нити, наконечники стрелок —инфекционные капли. Тепловая карта интенсивности флуоресцентногосигнала зеленого канала (синий цвет соответствует минимальнойинтенсивности сигнала, красный — максимальной) (В, Е, И, М, П).Наложение дифференциального интерференционного контраста и красногоканала (А, Г, Ж, К, Н), наложение зеленого и красного каналов (Б, Д, З, Л, О).Зеленый канал — АЦК, красный — ядра и бактерии.
Масштабная линейка =10 мкм.Результаты и обсуждение368Рисунок 84. — Иммунолокализация АЦК в 2-недельных клубенькахгороха линии дикого типа SGE (А-В) и мутантах (SGEFix−-1 (Pssym40)(Г–Е), SGEFix−-2 (Pssym33) (Ж–И), SGEFix−-3 (Pssym26) (К–М), andSGEFix−-7 (Pssym27) (Н–П))I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, III’ —зона, соответствующая зоне азотфиксации в клубеньках дикого типа.Тепловая карта интенсивности флуоресцентного сигнала зеленого канала(синий цвет соответствует минимальной интенсивности сигнала, красный —максимальной) (В, Е, И, М, П).
Наложение дифференциальногоинтерференционного контраста и красного канала (А, Г, Ж, К, Н), наложениезеленого и красного каналов (Б, Д, З, Л, О). Зеленый канал — АЦК, красный— ядра и бактерии. Масштабная линейка = 100 мкм.Результаты и обсуждение369Рисунок 85. — Иммунолокализация АЦК в 6-недельных клубенькахгороха линии дикого типа SGEКлетки из зоны азотфиксации (Ж-И) и зоны старения (К-М). I —меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, IV — зонастарения, ик — инфицированная клетка, дик — деградирующаяинфицированная клетка.
Тепловая карта интенсивности флуоресцентногосигнала зеленого канала (синий цвет соответствует минимальнойинтенсивности сигнала, красный — максимальной) (В, Е, И, М). Наложениедифференциального интерференционного контраста и красного канала (А, Г,Ж, К), наложение зеленого и красного каналов (Б, Д, З, Л). Зеленый канал —АЦК, красный — ядра и бактерии. Масштабная линейка (А-Е) = 100 мкм, (ЖМ) = 10 мкм.Результаты и обсуждение370В 6-недельных клубеньках дикого типа максимальный уровень сигналаАЦК наблюдался в меристематических клетках, клетках зоны инфекции изоны азотфиксации (Рисунок 85А–В, Ж–И). Также сильный уровень сигналанаблюдался в стареющих клетках (Рисунок 85Г–Е), которые еще неподверглись деградации в зоне старения (Рисунок 85К–И).Длятогонеэффективныхчтобыпроверитьклубеньках,былактивациюраннегопроанализированстарениярядвмутантов,блокированных на различных стадиях развития клубеньков.
МутантыSGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) формируют розово-зеленыеклубеньки, что указывает на фенотип раннего старения. Мутант SGEFix−-1(Pssym40) формирует белые неэффективные клубеньки с признаками раннегостарения, но развитие клубеньков блокировано на более ранней стадии, чем уSGEFix−-3 (Pssym26) и SGEFix−-7 (Pssym27) (Tsyganov et al., 1998). Нанаиболее ранней стадии развитие клубеньков блокировано у мутантаSGEFix−-2 (Pssym33), для этого мутанта не был описан фенотип раннегостарения (Tsyganov et al., 1998), но нами была показана активация защитныхреакций (см.
раздел 3.11) (Ivanova et al., 2015).Ранее, в том числе и нами, была изучена ультраструктурнаяорганизация клубеньков у аллельных мутантов RisFixM и RisFixT (смутациями в гене Pssym26) и мутанта RisFixQ (с мутацией в гене Pssym27)(Novák et al., 1995; Morzhina et al., 2000), полученных на сорте гороха Finale(Engvild,1987).Этидифференцированнымимутантыхарактеризуютсябактероидами,которыеморфологическипретерпеваютпреждевременную деградацию. В данном исследовании мы провелидетальное описание ультраструктурной организации клубеньков у аллельныхмутантов по генам Pssym26 и Pssym27, индуцированных на линии SGE. Обамутанта показали схожую ультраструктурную организацию клубеньков,сходную с таковой у аллельных мутантов, полученных на сорте Finale, идругими мутантами, проявляющими фенотип раннего старения (Kneen et al.,1990; Novák et al., 1995; Morzhina et al., 2000).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
