Диссертация (1144724), страница 57
Текст из файла (страница 57)
При отсутствии в гидропонном растворе CdCl2между линией дикого типа и мутантом SGECdt не наблюдалось различий вРисунок 86. — Организация кортикальных и митотическихмикротрубочек в кончиках корней у линии дикого типа SGE (А, В) имутантной линии SGECdt (Б, Г)(А, Б) 10 мкМ, (В, Г) 30 мкМ CdCl2. Я — ядро, стрелка указывает наверетено деления. Масштабная линейка (А, Б, В) = 10, (Г) = 5 мкм.организации как митотических, так и кортикальных микротрубочек.
Приконцентрации10мкМCdCl2меняласьориентациякортикальныхмикротрубочек от поперечной относительно продольной оси клетки — кпродольной (Рисунок 86А), в то время как у мутанта поперечная ориентациясохранялась (Рисунок 86Б). При концентрации 30 мкМ CdCl2 у линии дикоготипа микротрубочки полностью деполимеризовались (Рисунок 86В), тогдаРезультаты и обсуждение378как у мутанта SGECdt они сохранялись (Рисунок 86Г).
Таким образом,показано,чтомутантSGECdtспособенподдерживатьорганизациюмитотических и кортикальных микротрубочек при концентрациях CdCl2 всреде, вызывающих нарушения в их организации у растений линии дикоготипа SGE.3.13.5. Первичная локализация локуса cdt (cadmium tolerance) нагенетической карте гороха с использовванием метода SSAP (sequencespecific ampliphied polymorphism)Для первичной локализации мутации cdt на генетической карте горохабыл использован SSAP-анализ (см. раздел 2.5.11).
Для создания SSAPмаркеров, по которым различались бы линии SGECdt и JI281, былииспользованы следующие праймеры к Taq адаптеру с парами селективныхоснований: TC, AA, TG, TA, AT, AG, AC и GA. В случае использованияпраймера с селективными основаниями TC родительские линии отличалисьпо 13 маркерам (Рисунок 87), AA — по 12 маркерам, TG — по 14 маркерам,TA — по 10 маркерам, AT — по 15 маркерам, AG — по 17 маркерам, GA —по 8 маркерам. В результате было выявлено 89 SSAP маркеров.Был проведен анализ совместного наследования выявленных SSAPмаркеров и признака устойчивости к кадмию.
В ходе анализа F3 по признакуустойчивости к кадмию возникли сложности с выявлением фенотипическихразличий между растениями. Данные трудности оказались связаны сповышенной, по сравнению с исходной линией SGE, устойчивостью линииJI281 к хлориду кадмия, что привело к ошибочному в ряде случаевопределению фенотипа и, как следствие, значительному превышению классарецессивных гомозигот (проявляющих устойчивость к хлориду кадмия).Поэтомупризнакустойчивостиккадмиюнеанализировалсякаккодоминантный при анализе совместного наследования. Тем не менее, быловыявлено сцепление локуса cdt с 8 SSAP маркерами. 4 из них представлялисобой новые маркеры, характерные для линии SGECdt, другие 4 былиРезультаты и обсуждение379идентифицированы как ранее описанные маркеры в скрещиваниях cучастием линии JI281: Tps1/146+, Tps1/167+, Tps1/44+ и Tps1/58+/ (Таблица36).
Данные маркеры локализованы в VI группе сцепления гороха (Рисунок88), на основании чего был сделан вывод о принадлежности локуса cdt кданной группе сцепления.Таблица 36. Анализ расщепления по фенотипу растений поколенияF2 от скрещивания линии JI281 и мутанта SGECdtПарымаркеровЧисленностьфенотипических классовРасстояние, сM± ст. ошибкаОбщийχ2P9:3:3:1ABAbaBabВсегоcdt–Tps1/146+13127256629,55±6,917,740,01cdt–Tps1/167+684566532,60±10,9013,390,0005cdt–Tps1/44+2114335923,13±12,2034,150,0001cdt–Tps1/58+864846627,11±11,2610,610,005A,a — первый ген, B,b — второй ген.
Если оба гена доминантны,заглавные буквы обозначают доминантные аллели.В данном исследовании были использованы 8 праймеров к Taqадаптеру с селективными основаниями, что составляет половину отвозможных комбинаций, при этом было получено 89 SSAP маркеров, покоторым различались скрещиваемые линии. Таким образом, использованиеполного набора комбинаций праймеров позволяет получить 150-200 SSAPмаркеров.
Безусловно, такоеколичествомаркеров создает хорошиепредпосылки для первичной локализации исследуемой мутации. При этомравномерное распределение ретротранспозонов по геному гороха (Suoniemiet al., 1996; Kumar et al., 1997) позволяет охватить все группы сцепления.Использование метода SSAP представляется перспективным для проведенияРезультаты и обсуждениеисследованийпопервичной380локализациинеизвестноймутациинагенетической карте.Рисунок 87. — SSAP анализРисунок показывает авторадиографический снимок, позволяющийвидеть SSAP продукты. Продукты получены из F2 от скрещивания линииJI281 с мутантной линией SGECdt с использованием ПЦР-праймера,специфичного к PPT (polypurine tract) ретротранспозона гороха PDR1,меченного изотопом фосфора 33P и праймера, с селективными основаниямиTC, соответствующего сайту адаптера Taq I.Результаты и обсуждение381cdtРисунок 88.
— Генетическая карта района локализации локуса cdt иSSAP маркеровВ данном исследовании SSAP маркеры были использованы дляпервичной локализации мутации по локусу cdt, приводящей к повышенной,по сравнению с линией дикого типа, устойчивости к кадмию и увеличеннойаккумуляции кадмия в тканях растения. Возникшие трудности в определениифенотипа при анализе растений F2 связаны с определенной сложностью впроявлении данного признака, зависящего от генетического фона ифизиологической стадии развития растений, на которой в среду добавляетсяхлорид кадмия. Тем не менее, был установлен факт сцепления с 4 SSAPмаркерами VI группы сцепления гороха, при этом для 3 из них вероятностислучайного отклонения от независимого наследования с локусом cdt быликрайне низки.Следует отметить, что до недавнего времени у высших растений небыло описано мутаций, приводящих к повышенной устойчивости к кадмиюРезультаты и обсуждение382(Кулаева, Цыганов, 2010).
Лишь совсем недавно у Arabidopsis thaliana быливыявлены мутанты, характеризующиеся повышенной устойчивостью ккадмию, однако молекулярная природа данных мутаций еще не выяснена(Watanabe et al., 2010).Таким образом, проведенная первичная локализация мутантноголокуса cdt позволяет провести его дальнейшее точное картирование нагенетической карте.3.13.6. Точная локализация локуса cdt (cadmium tolerance) нагенетической карте гороха с использовванием молекулярных маркеровИсходя из первоначальной локализации мутации cdt в VI группесцепления на основе последовательностей известных генов гороха (Ellis,Poyser, 2002; Kaló et al., 2004; Aubert et al., 2006) были разработаны маркерыPskn16, HptB, SUS3. Был проведен анализ совместного наследованияпризнака устойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров(Таблица 37).Основываясьнаполученныхданных,былпроведенанализмикросинтении геномов P.
sativum и M. truncatula. Был выявлен регионвторой группы сцепления M. truncatula, в пределах которого расположенпредполагаемый ортолог локуса cdt, при этом было установлено, что данныйрегион инвертирован относительно гомологичной области у P. sativum.С использованием ресурса arabidopsis.org были отобраны различныегены A. thaliana, экспрессия которых изменяется при действии тяжелыхметаллов. Последовательности данных генов были подвергнуты BLASTанализудлявыборатехгенов,длякоторыхгомологичныепоследовательности у M.
truncatula располагались в выявленном ранеерайоне второй группы сцепления. Последовательности данных генов былииспользованы для разработки новых маркеров: HMA3, S27E, IF4E и GH. Былпроведен анализ совместного наследования признака устойчивости к кадмиюи разработанных молекулярных маркеров (Таблица 38).Таблица 37. Анализ расщепления по фенотипу растений поколений F2 и F3 от скрещивания линий JI281 иSGECdtaBaHabСцепление, сM± ст. ошибкаОбъединенныйχ2P(9:3:3:1)3021011,22±5,1221,80,00011620198,0±4,7322,30,000115306919,7±6,8112,80,005парамаркеровABAHAbcdt-Pskn16819cdt-HptB7cdt-SUS38HBHHHbA,a — первый ген, B,b — второй ген, H — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначаютдоминантные аллели.
Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантную аллель первогогена, заглавная B обозначает в этом случае аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А. Если обагена кодоминантны, заглавной буквой обозначена аллель первого родителя.Результаты и обсуждение384Таблица 38.
Анализ расщепления по фенотипу растений поколений F2 и F3 от скрещивания линий JI281 иSGECdtСцепление,пара маркеровABAHAbcdt-HMA315279cdt-S27E18381cdt-IF4E1937cdt-GH1837Объединенныйχ2P(9:3:3:1)27,9 ±6,1111,20,005182,6 ±1,8565,70,00010191,31±1,2170,90,00012162,6±1,8765,70,0001aBaHabсM ± ст.ошибка2611011010HB0HHHbA,a — первый ген, B,b — второй ген, H — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначаютдоминантные аллели. Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантную аллель первогогена, заглавная B обозначает в этом случае аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А. Если обагенакодоминантны,заглавнойбуквойобозначенааллельпервогородителя.Для уточнения локализации локуса cdt и подтверждения полученныхранее данных был проведен анализ совместного наследования признакаустойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров сиспользованием второй независимо полученной популяции поколения F2,полученной от скрещивания мутанта SGECdt и линии JI281.
Также сиспользованием поколения F2 были проанализированы молекулярныемаркеры P450, PTP, AAA, P450, PTAC и EX, разработанные c цельюдетализации расположения локуса cdt (Таблица 39).На основании полученных данных с использованием программыAntMap была построена карта взаимного расположения локуса cdt иразработанных маркеров (Рисунок 89) и выявлена локализация локуса cdt врегионе, ограниченном маркерами PTP и EX.Рисунок 89. — Генетическая карта района локализации локуса cdtТаблица 39. Анализ расщепления по фенотипу растений поколений F2 от скрещивания линий JI281 иSGECdtaBaHabСцепление,сM ± ст.ошибка003154,5±2,5358,30,0001269261128,1±6,2810,90,0053588303413,4±1,42140,30,0001cdt-IF4E3689100440,56±0,52164,90,0001cdt-AAA3589200441,1±0,82160,00,0001cdt-P4503491100431,1±0,82159,70,0001cdt-PTAC3589100440,56±0,52164,90,0001cdt-PTP3690000441700,0001пара маркеровABAHAbcdt-HptB2530cdt-HMA315cdt-S27EHBHHHbОбъединенныйχ2P(9:3:3:1)Результаты и обсуждениеcdt-EX3591387000441700,0001A,a — первый ген, B,b — второй ген, H — гетерозигота.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
