Диссертация (1144724), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Экспрессия fixNc в клубеньках E135f (Pssym13) была идентичнатаковой в клубеньках дикого типа Sparkle (Таблица 30). Необходимоотметить, что, хотя слияние fixNc–gusA, использованное в данной работе,показало низкие уровни экспрессии, оно индуцировалось при низкихконцентрациях кислорода. В культурах свободноживущих ризобий βглюкоронидазная активность данного слияния составила 0,15 нМ мин−1 мгбелок−1 при нормальных аэробных условиях и была почти в 50 раз выше (7,3нМ мин−1 мг белок−1) в бактериях, выращенных в микроаэробных условиях.Экспрессия слияния dctA–lacZ на плазмиде pCR12 индуцируетсядикарбоновыми кислотами.
У бактерий, растущих на минимальной среде сманнитолом в качестве источника углерода, β-галактозидазная активностьданного слияния составила 40 нМ мин−1 мг белок−1 и возрастала до 1700 нМмин−1 мг белок−1, когда источник углерода был заменен 10 мМ сукцинатомнатрия. Также как это было показано для не симбиотических генов,экспрессия слияния dctA–lacZ в клубеньках находилась в обратнойкорреляции с уровнем дифференцировки бактероидов. По сравнению сазотфиксирующими клубеньками дикого типа, экспрессия значительноувеличивалась в клубеньках генотипов, несущих мутацию Pssym31,увеличивалась в клубеньках мутанта по гену Pssym32 и лишь незначительноРезультаты и обсуждение330возрастала (в 1,4 раза) в клубеньках мутанта по гену Pssym13 (Таблица 30).Полученныерезультатыисследованиями,находятсяпоказавшими,чтовсоответствиипоглощениеспредыдущимималатаусиленовбактероидах, изолированных из клубеньков мутанта по гену Pssym31 (Borisovet al., 1996).
Способность бактерий поглощать C4-дикарбоновые кислоты(фумарат, малат, сукцинат) определяется геном dctA, необходимым дляазотфиксации в симбиотических клубеньках (Ronson et al., 1981; Watson etal., 1988; Van Slooten et al., 1992). У R. leguminosarum bv. viciae и S. melilotiсистема Dct состоит из 3-х генов. Ген dctA кодирует высокоаффиннуюсистему поглощения дикарбоновых кислот. Экспрессия dctA контролируетсядвухкомпонентной регуляторной системой (dctB, dctD) отвечающей наприсутствие дикарбоновых кислот (Ronson, Astwood, 1985). Несмотря на то,что функционирование dctA необходимо для азотфиксации, тот факт, чтоэкспрессия dctA выше в клубеньках, содержащих недифференцированныебактероиды, чем в клубеньках дикого типа, указывает на то, что индукцияdctA в клубеньке также снижается во время перехода от ювенильногобактероидакполностьюдифференцированному.Этокажетсяпарадоксальным, что ген, необходимый для азотфиксации, экспрессируетсяна более высоком уровне в ювенильных, не фиксирующих азот бактероидах.Тем не менее, возможно, что dctA также требуется для развития бактероидови/или, что индуцибельная экспрессия dctA также является объектом общегоснижения экспрессии генов, которое, по-видимому, происходит во времясозревания бактероидов.
Это предположение находится в соответствии с темфактом, что активация дикарбоновыми кислотами не является необходимойдля экспрессии dctA в азотфиксирующих бактероидах S. meliloti и можетбыть заменена зависимым от кислорода типом регуляции (Boesten et al.,1998). Более того, определенные мутации в dctB ведут к конститутивнойнезависимой от дикарбоновых кислот экспрессии dctA и поглощениюсукцината, приводя к резкому снижению азотфиксации. Это подтверждает,что не только поглощение дикарбоновых кислот, но и правильная регуляцияРезультаты и обсуждение331экспрессии dctA являются важными для функционирования бактероидов(Mavridou et al., 1995).Была также проверена индукция слияния nodA–lacZ на плазмидеpMP240 флавоноидами. β-галактозидазная активность в условиях безиндукции составила 0,212 мкМ мин−1 мг белок−1 в сравнении с 6 мкМ мин−1мг белок−1, наблюдаемыми, когда к бактериальной культуре было добавлено0,4 мкM нарингенина.
Подобно слиянию dctA–lacZ, слияние nodA–lacZпоказало высокий уровень экспрессии в мутантных клубеньках, содержащихнедифференцированные бактероиды, по сравнению с клубеньками дикоготипа (Таблица 30). Предполагалось, что индуцибельная флавоноидамиэкспрессия nod генов активно ингибируется в бактероидах, хотя все ещеостается неизвестными полностью ли она репрессируется (Schlaman et al.,1991; Schlaman et al., 1992; Timmers et al., 1998). Также неясно,репрессируются ли nod гены сразу после выхода бактерий в цитоплазмурастительной клетки, или это событие связано с какой-либо стадиейдифференцировки бактероидов. Репрессия nod генов в клетках хозяина, повидимому, опосредована NodD2 у Rhizobium sp. NGR234 и может быть важнадля нормального развития бактероидов у определенных видов растений(Fellay et al., 1998).
Уровни экспрессии nod генов в клубеньках дикого типа,возможно, представляют максимум репрессии. В этом случае мы можемпредставить прямую корреляцию между развитием бактероида и степеньюрепрессии гена nodA. Наибольший уровень экспрессии наблюдался вклубеньках, содержащих в основном ювенильные бактероиды (линии гороха,несущие мутацию Pssym31), он снижался в клубеньках линии RisFixL(Pssym32), еще сильнее в клубеньках мутанта по гену Pssym13, которыйсодержит почти полностью дифференцированные бактероиды, а самыйнизкий уровень экспрессии наблюдался в клубеньках дикого типа (Таблица30).
Можно предположить, что активная репрессия nod генов, индуцируемыхфлавоноидами, такжепостепенноесобытие, связанноес процессомРезультаты и обсуждение332дифференцировки бактероидов, так, что максимум репрессии достигаетсятолько в полностью дифференцированных азотфиксирующих бактероидах.3.10.2.2. КоличествокультивируемыхбактерийизклубеньковгорохаДля видов семейства Бобовых, принадлежащих к кладе IRLC (InvertedRepeat-Lacking Clade), к которой относится и горох, характерны ярковыраженные морфологические изменения ризобий при их дифференцировкев бактероиды, которая является необратимой. Культивируемые бактерии (т.е.способные возвратиться к свободноживущему состоянию), высеянные из 4-хнедельных клубеньков дикого типа должны происходить в основном изинфекционных нитей.
Очевидно, что культивируемые бактерии, высеянныеизклубеньков,могуттакжепроисходитьотнеполностьюдифференцированных бактероидов, которые все еще способны к возврату всвободноживущее состояние. Из клубеньков мутантов по генам Pssym31 иPssym32, в которых дифференцировка бактероидов блокирована на раннейстадии после выхода бактерий в цитоплазму растительной клетки,количество выделяемых культивируемых бактерий было больше в 60 и 40раз, соответственно, чем из клубеньков соответствующих генотипов дикоготипа (Таблица 31).
В противоположность дикому типу симбиосомы в этихмутантных клубеньках содержат несколько бактероидов, что подтверждает,что после выхода бактерии все еще сохраняют способность к делениям(Borisov et al., 1997; Morzhina et al., 2000). Таким образом, бактерии,вышедшие из инфекционных капель, в мутантных клубеньках, вероятно,сохраняют способность вернуться к свободноживущему состоянию. Этоподтверждает, что даже будучи окруженными симбиосомной мембраной,недифференцированные бактероиды сильно отличаются от полностьюдифференцированных по физиологическим параметрам.Результаты и обсуждение333Таблица 31. Число культивируемых бактерий, выделенных изклубеньков гороха линий дикого типа и мутантных линийГенотип горохаЧисло единиц,формирующих колонии, вклубеньках (104 / мг сыроговеса клубенька)Sprint-2 (дикий тип)8,2±1,3Sprint-2Fix− (Pssym31)b525.2±200,4 (64)RBT (Pssym13, Pssym31)1058,7±154,3a (259)RisFixL (Pssym32)696,0±110,0a (38)Finale (дикий тип)18,1±2,6E135f (Pssym13)144,2±43,8a (53)Sparkle (дикий тип)2,7±0,6В скобках приведено соотношение между мутантной исоответствующей линией дикого типа.
Для двойного мутанта RBT (Pssym13,Pssym31), это соотношение рассчитано как среднее соотношений Sprint-2 иSparkle.Средние значения достоверно различаются (P>0,95) от значенийсоответствующих линий дикого типа (линия RBT (Pssym13, Pssym31) быласравнена с линией Sprint-2 и сортом Sparkle).aSprint-2Fix− (Pssym31) не отличался достоверно от дикого типа из-завысокой вариабельности данных между повторностями измерений.bНеожиданным для нас результатом оказался тот факт, что изклубеньков мутанта E135f (Pssym13), проявляющего фенотип раннегостарения, также выделялось в 50 раз больше культивируемых бактерий посравнениюсдикимморфологическимитипом(Таблицаисследованиями, в31).которыхЭтоконтрастируетбылопоказано,счтоклубеньки содержат почти полностью дифференцированные бактероиды(Kneen et al., 1990).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
