Диссертация (1144724), страница 47
Текст из файла (страница 47)
В инокулированных корнях гороха дикого типаSparkle и мутантов была проведена иммунолокализации АЦК.Таблица 24. Влияние этилена на развитие симбиотическихклубеньков у дикого типа Rondo и мутантной линии K5 (Pssym12)Вариант опытаКоличествоклубеньковRondo, главный корень11,0±1,27Rondo, боковые корни27,0±3,32Rondo, вся корневая система36,0±2,34Rondo, главный корень + АВГ8,4±1,72Rondo, боковые корни + АВГ61,0±6,70Rondo, вся корневая система + АВГ69,4±5,52ARondo, главный корень + АЦК10,2±1,93Rondo, боковые корни + АЦК10,4±2,91Результаты и обсуждение305Rondo, вся корневая система + АЦК20,6±1,86ARondo, главный корень + этефон5,8±1,32Rondo, боковые корни + этефон19,2±5,42Rondo, вся корневая система +этефон25,0±4,18K5, главный корень0K5, боковые корни19,8±8,52K5, вся корневая система19,8±8,52BK5, главный корень + АВГ0K5, боковые корни + АВГ40,4±14,9K5, вся корневая система + АВГ40,4±14,9K5, главный корень + АЦК0K5, боковые корни + АЦК0,2±0,20K5, вся корневая система + АЦК0,2±0,20BK5, главный корень + этефон0,2±0,20K5, боковые корни + этефон3,6±1,75K5, вся корневая система + этефон3,8±1,66B— варианты опыта достоверно отличаются от контрольного вариантаRondo (P>0,99).B— варианты опыта достоверно отличаются от контрольного вариантаK5 (P>0,99).АВГ — обработка аминоэтоксивинилглицином (10 мкМ), АЦК —обработка 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислотой (10 мкМ).AРезультаты и обсуждение306Рисунок 61.
— Влияние этилена на развитие симбиотическихклубеньков у дикого типа Rondo и мутантной линии K5 (sym12)А — Rondo, Б — K5, В — Rondo + АВГ, Г — K5 + АВГ, Д — Rondo +АЦК, Е — K5 + АЦК. Стрелки указывают на клубеньки. АВГ — обработкааминоэтоксивинилглицином (10 мкМ), АЦК — обработка 1аминоциклопропан-1-карбоновой кислотой (10 мкМ).Результаты и обсуждение307Рисунок 62. — Развитие клубенька у мутанта К5 (Pssym12)(А) Блокирование развития клубенька на стадии формирования зрелогопримордия на 23-й ДПИ. (Б) Блокирование развития на стадии формированияклубеньковой меристемы на 23-й ДПИ.
(В) Зрелый клубенек на 23-й ДПИ. I— меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, наконечникистрелок указывают на инфекционную нить. Масштабная линейка (А, Б) = 0,2мм, (В) = 0,4 мм.Результаты и обсуждение308При анализе выбранных участков корней у дикого типа наблюдаласьразветвленная сеть инфекционных нитей в наружных и внутренних слояхкоры (Рисунок 63А, Б). При этом было показано, что вокруг инфекционныхнитей, продвигающихся вглубь корня, отсутствует метка АЦК (Рисунок 63Б).В то же время те нити, которые росли горизонтально, не продвигаясь вглубькорня,очевидно,подвергалисьабортации,вокругнихактивноаккумулировалась АЦК (Рисунок 63Б).
При исследовании абортированнойнити, рост которой остановился в наружных слоях коры, была показанаактивная аккумуляция АЦК в клетках, через которые проходит нить(Рисунок 63В, Г).Рисунок 63. — Иммунолокализация 1-аминоциклопропан-1-карбоновойкислоты в колонизированных клетках (через которые проходитинфекционная нить) гороха сорта Sparkle.Результаты и обсуждение309А, Б — нормальное развитие инфекционной нити. В, Г —абортированная инфекционная нить.
я — ядро, стрелка указывает наинфекционную нить, треугольник на абортированную инфекционную нить,наконечник стрелки — корневой волосок. А, В — дифференциальноинтерференционный контраст (ДИК), красный и зеленый канал. Б, Г —наложение зеленого и красного каналов. Зеленый канал — АЦК, красныйканал — ДНК ядер и бактерий. Масштабная линейка = 20 мкм.У мутанта E2 по гену Pssym5 наблюдалась абортация инфекционныхнитей в наружных слоях коры корня (Рисунок 64А, Б). В этих клеткахнаблюдалась накопление АЦК вокруг абортированных нитей (Рисунок 64А,Б).
У мутанта R50 по гену Pssym16 также наблюдалась абортацияинфекционных нитей, хотя, в отличие от мутанта E2 (Pssym5) они былиспособны проникать в более глубокие слои коры. Вокруг абортированныхнитей также наблюдалась накопление АЦК (Рисунок 64В, Г).Рисунок 64. — Иммунолокализация 1-аминоциклопропан-1-карбоновойкислоты в колонизированных клетках (через которые проходитинфекционная нить) гороха мутантов E2 (Pssym5) (А, Б) и R50 (Pssym16).Результаты и обсуждение310я — ядро, стрелка указывает на инфекционную нить, треугольник наабортированную инфекционную нить, наконечник стрелки — корневойволосок. А, В — дифференциально-интерференционный контраст (ДИК),красный и зеленый канал. Б, Г — наложение зеленого и красного каналов.Зеленый канал — АЦК, красный канал — ДНК ядер и бактерий.
Масштабнаялинейка = 20 мкм.Ранее для мутанта гороха E2 (Pssym5) было описано блокированиероста инфекционных нитей в наружных слоях коры и остановка делений вклетках внутренней коры, что приводит к уменьшению числа примордиев иклубеньков (Guinel, LaRue, 1991). У мутанта R50 (Pssym16) большинствоинфекционных нитей развиваются в наружных слоях коры, а клубеньковыйпримордий формируется клетками, претерпевшими в основном лишьантиклинальные деления, что приводит к его уплощению (Guinel, Sloetjes,2000). Мутантные фенотипы обоих мутантов супрессировались прииспользовании ингибиторов биосинтеза и действия этилена (Guinel, LaRue,1991; Guinel, Sloetjes, 2000). В данном исследовании была проанализированаиммунолокализация АЦК на ранних стадиях развития клубенька гороха.Было показано, что у дикого типа Sparkle при нормальном развитии вклетках, через которые проходит инфекционная нить, не наблюдаетсялокализация АЦК.
В то же время известно, что при развитии бобоворизобиального симбиоза значительное число инфекций ингибируется (Vasseet al., 1993). Абортированные инфекционные нити были ассоциированы собильным накоплением АЦК. При изучении мутантов E2 по гену Pssym5 иR50 по гену Pssym16, для которых характерна абортация инфекционныхнитейвнаружныхпродемонстрированаивнутреннихлокализацияслояхАЦКкоры,вокругтакжебылаабортированныхинфекционных нитей.
Таким образом, вероятно, этилен негативно влияет наразвитие инфекционной нити, регулируя число успешных инфекций.Изученный в данном исследовании мутант K5 (Pssym12) блокирован наболеепозднейстадии,посравнениюсранеевыявленнымиРезультаты и обсуждение311этиленчувствительными мутантами E2 (Pssym5) и R50 (Pssym16) — настадии формирования зрелой меристемы клубенька. Таким образом, можнозаключить, что этилен вовлечен в регуляцию развития клубенька наразличных стадиях: от самых ранних (Oldroyd et al., 2001) (см.
раздел1.1.15.4) до поздних — на стадии формирования меристемы, как былопоказано в данном исследовании. Роль этилена в функционированиимеристемы была также показана нами с использованием иммунолокализацииАЦК (см. раздел 3.12.4). Ранее было показано, что этилен негативнорегулирует пролиферацию клеток в апикальной меристеме корня и былопредположено, что он способствует сдвигу от митотического цикла кэндоредупликации, что приводит к ограничению пролиферации клеток (Streetet al., 2015).
В клубеньках сходный сдвиг наблюдается в зоне инфекции,когда клетки, инфицированные ризобиями, увеличиваются в размерахблагодаря повторяющимся циклам эндоредупликации.3.9. Анализ роли нитратов в реализации генетической программысимбиогенеза у гороха и L. japonicus3.9.1.Анализролинитратоввразвитиисимбиотическихдействиенитратовнаклубеньков у горохаБылопроанализированоколичествоформируемых клубеньков у генотипов дикого типа Sparkle и Sprint-2 имутантных генотипов E135f (Pssym13), Sprint-2 Fix− (Pssym31), RBT(Pssym13,Pssym31).Нитратывызывалипочти50%ингибированиеколичества клубеньков у растений дикого типа — сорта Sparkle и линииSprint-2 (Таблица 25).
В то же время накопление биомассы растенийувеличивалось, чтосвидетельствовалооб оптимизации их питания.Аналогично вел себя мутант E135f (Pssym13) (Таблица 25). В то же времямутант Sprint-2 Fix− (Pssym31) и двойной мутант RBT (Pssym13, Pssym31) вданных условиях показывали устойчивость к нитратам в отношениирегуляции количества формируемых на корнях клубеньков (Таблица 25).Результаты и обсуждение312Ранее нитрат-зависимая регуляция клубенькообразования была изученау Fix− мутантов гороха RisFixO (Pssym32) (блок развития симбиотическихкомпартментов на стадии, близкой к контролируемой геном Pssym31) иRisFixV (Pssym42) (преждевременная деградация симботических структур)(Morzhina et al., 2000).
Было показано, что оба мутанта реагируют наэкзогенные нитраты сходно с родительской линией дикого типа (Novak et al.,1993). Ген PsSym31, мутации в котором также приводят к фенотипу Fix−, былидентифицирован как единственный к настоящему моменту симбиотическийгенгороха,симбиотическиходновременнокомпартментовконтролирующийидифференцировкунитрат-зависимуюрегуляциюклубенькообразования.Кроме того, представленные данные свидетельствуют о том, что вотношении данного типа регуляции ген PsSym13 эпистатичен гену PsSym31.То есть, при рассмотрении этого признака функция гена PsSym31 необходимана более раннем этапе развития симбиотических клубеньков, чем функциягенаPsSym13,чтоподтверждаетранеевыявленныйфактопоследовательности функционирования изучаемых генов (Borisov et al.,1997).Таблица 25. Влияние экзогенных нитратов на сырую, сухую массупобегов и число клубеньков мутантных и исходных линийЛинии горохачисло растенийсухая массапобегов,г/растениечисло клубеньков нарастенииSprint-2100,25±0,02127±39ASprint-2 + NO3−100,31±0,0558±15ASprint-2Fix−140,06±0,0199±24Sprint-2Fix− +NO3−100,13±0,0299±16Sparkle100,23±0,03116±35BSparkle + NO3−90,29±0,0354±9BE135f120,20±0,02582±31CРезультаты и обсуждение313E135f + NO3−100,24±0,02354±25CRBT100,13±0,02112±18RBT + NO3−110,18±0,02101±24Средние значения, отмеченные одинаковыми буквами, указывают настатистически достоверные различия, наблюдаемые между контрольнымвариантом и вариантом с добавлением NO3− (Р>0,95).3.9.1.Анализролинитратоввразвитиисимбиотическихклубеньков у L.
japonicusС целью оценки чувствительности клубенькообразования у лядвенца кэкзогенным нитратам был проведен сравнительный анализ растений дикоготипа линии Gifu и 5 мутантов (по генам Ljsym10, Ljsym12, Ljsym13, Ljsym61 иLjsym67), неспособных фиксировать атмосферный азот.В присутствии нитратов наблюдалась выраженная тенденция кснижению числа клубеньков у растений дикого типа. Аналогично вел себямутант по гену Ljsym67. В то же время мутанты по генам Ljsym10 и Ljsym12 вданных условиях показали устойчивость к нитратам, т.к.
количествоформируемых на корнях клубеньков не изменилось (Таблица 26). Особенноинтересно выявление мутанта по гену Ljsym10, который проявляет не толькоустойчивость к нитратам, но и формирует увеличенное, по сравнению сдиким типом, число белых клубеньков. Данный фенотип весьма сходен сфенотипом мутанта гороха по гену Pssym31. Однако необходимы детальныедальнейшие исследования структуры клубеньков мутанта по гену Ljsym10,чтобы поставить вопрос о возможной гомологии генов Ljsym10 у лядвенцаяпонского и Pssym31 гороха. Интересно отметить, что экзогенный нитрат нетолько не ингибировал, но, наоборот, стимулировал клубенькообразование умутантов по генам Ljsym13, Ljsym61. Ранее был описан стимулирующийэффект на клубенькообразование лишь очень низких доз нитратов, поэтомуобнаруженный в данной работе эффект требует дальнейшего изучения.Результаты и обсуждение314Таблица 26.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
