Диссертация (1144724), страница 42
Текст из файла (страница 42)
(Rathbun et al., 2002) показали, чторайон3'-нетранслируемый(3'-UTR)мРНКгена,кодирующегоарабиногалактанпротеин-экстензин, у гороха крайне консервативен посравнению с таковым у ортологичного гена M. truncatula MtN12. При этом на3'-UTRмРНКнаходятсяMtN12многочисленныеUUGU-сайтыдлясвязывания белков семейства Pumilio (PUF), которые вовлечены вобеспечение полярности клеток, например, у почкующихся дрожжей(Puf6p/ASH1 мРНК; Puf3p/Mdm12p мРНК) (Gu et al., 2004; García-Rodríguez etal., 2007), но их роль в растительных клетках не установлена. PUF белкисвязываются в качестве мишени с 3’-UTR последовательностью мРНК,несущей UUGU мотив (Gerber et al., 2004). Перед выходом из ядра димеры изРНК и белка ассоциируются в большие рибонуклеопротеиновые комплексы,который у почкующихся дрожжей называется «локасомой», содержащейкомпонентыShe2p,She3p,Myo4p,подавляющиетрансляциюиспособствующие передвижению РНК вдоль поляризованного актиновогоцитоскелета в направлении предопределенного района клетки (Gu et al.,2004).
Можно прежположить, что PUF белки участвуют в поляризованномапикальном росте инфекционных нитей. Таким образом, у мутантов саномальнымразвитиеминфекционныхнитейвезикулы,несущиеарабиногалактанпротеин-экстензины, отклоняются в сторону межклеточногоматрикса, а не в сторону просвета инфекционных нитей.У одиночных и двойных мутантов по гену Pssym33 в некоторыхинфекционных нитях отсутствовала метка МАС265. В таких инфекционныхнитях наблюдались признаки деградации бактерий: появлялись каплиполиоксибутиратавцитоплазме,расширялосьпериплазматическоепространство и происходил лизис бактериальных клеток. Также у мутантаРезультаты и обсуждение267RisFixV (Pssym42) наблюдалось отсутствие метки МАС265 в части матриксанекоторых инфекционных нитей.Полученные результаты показывают важность механизма направленнойсекреции арабиногалактанпротеин-экстензинов в просвет инфекционной нитидля ее нормального функционирования.3.6.
Анализ роли пероксида водорода в реализации генетическойподпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у горохаИспользованная в работе серия симбиотических мутантов гороха споследовательными нарушениями симбиогенеза является удобной модельюдля анализа роли различных соединений при развитии клубенька.В двухнедельных клубеньках исходной линии SGE пероксид водородаактивно откладывался в стенках инфекционных нитей, причем количествопреципитатов пергидроксида церия увеличивалось по мере их созревания(Рисунок 43А-Д).
Пероксид водорода также присутствовал в матриксеинфекционных капель (Рисунок 43Е). В стареющих клубеньках преципитатыпергидроксидацерияактивнонакапливалисьвокругдеградирующихбактероидов (Рисунок 43Ж), в стенках инфекционных нитей (Рисунок 43З) ивокруг бактерий в инфекционных каплях (Рисунок 43И).У мутанта SGEFix−-1 (Pssym40) преципитаты пергидроксида цериянакапливались в стенках инфекционных нитей при их созревании сходнымобразом с диким типом (Рисунок 44А, Б), вокруг бактерий в инфекционныхнитях (Рисунок 44В), а также вокруг ювенильных бактероидов (Рисунок 44Г,Д).
Активная аккумуляция преципитатов пергидроксида церия такженаблюдаласьвмежклеточномпространстве,соседствующими клетками (Рисунок 44Е).формируемом3-мяРезультаты и обсуждение268Рисунок 43. — Локализация пероксида водорода в симбиотическихклубеньках гороха дикого типа SGE(А-Д) последовательные стадии накопления пероксида водорода винфекционной нити от внутренней стенки инфекционной нити (А) через всютолщину стенки инфекционной нити (Г) с последующим отложением вматриксе инфекционной нити (Д). (Е) отложение пероксида водорода вматриксе инфекционной капли.
(Ж-И) отложение пероксида водорода встареющих инфицированных клетках: вокруг бактероидов (Ж), в стенке иматриксе инфекционной нити (З) и в матриксе инфекционной капли (И).Пероксид водорода откладывается в виде электронно-плотных преципитатовпергидроксида церия (показаны стрелками). ин — инфекционная нить, ик —инфекционная капля, син — стенка инфекционной нити, б — бактерия, дба— деградирующий бактероид. Масштабная линейка = 500нм.Результаты и обсуждение269Рисунок 44.
— Локализация пероксида водорода в симбиотическихклубеньках гороха мутанта SGEFix−-1 (Pssym40)(А-В) последовательные стадии накопления пероксида водорода винфекционной нити от внутренней стенки инфекционной нити (А) через всютолщину стенки инфекционной нити (Б) с последующим отложением вматриксе инфекционной нити и вокруг бактерий (В). (Г и Д) отложениепероксида водорода вокруг ювенильных дифференцирующихся бактероидов.(Е) отложение пероксида водорода в растительных клеточных стенках имежклеточном матриксе. Пероксид водорода откладывается в видеэлектронно-плотных преципитатов пергидроксида церия (показаныстрелками).
кс — клеточная стенка, мкп — межклеточное пространство, ин— инфекционная нить, син — стенка инфекционной нити, б — бактерия, юба— ювенильный бактероид. Масштабная линейка (Г) = 2 мкм, (А-В, Д и Е) =500 нм.Для мутанта SGEFix−-2 (Pssym33) была характерна аккумуляциякрупных преципитатов пергидроксида церия с наружной поверхности стенокутолщенных инфекционных нитей (Рисунок 45А), хотя отложение мелкихперципитатов также наблюдалось (Рисунок 45Б, В), в том числе и в толщестенки инфекционной нити (Рисунок 45В). Для данного мутанта характерноредкое формирование инфекционных капель, в которых наблюдалосьРезультаты и обсуждение270чрезмерное накопление пероксида водорода в матриксе и вокруг бактерий(Рисунок 45Г).Рисунок 45.
— Локализация пероксида водорода в симбиотическихклубеньках гороха мутанта SGEFix−-2 (Pssym33)(А) накопление пероксида водорода на внешней поверхности стенкиинфекционной нити и на растительной клеточной стенке в виде крупныхпреципитатов. (Б и В) отложение пероксида водорода на внешнейповерхности и в толще стенки инфекционной нити в виде мелкихпреципитатов (Б) и более крупных отложений (В). (Д) чрезмерноенакопление пероксида водорода в матриксе и вокруг бактерий винфекционной капле. Пероксид водорода откладывается в виде электронноплотных преципитатов пергидроксида церия (показаны стрелками).
кс —клеточная стенка, ин — инфекционная нить, ик — инфекционная капля, син— стенка инфекционной нити, б — бактерия. Масштабная линейка (А) = 2мкм, (Б-Г) = 500нм.При анализе клубеньков дикого типа сорта Finale также наблюдалосьактивноеотложениепреципитатовпергидроксидаинфекционных нитей при их созревании.цериявстенкахРезультаты и обсуждениеУмутантаRisFixV271(Pssym42)аккумуляцияпреципитатовпергидроксида церия наблюдалась в матриксе инфекционных нитей и капель(Рисунок 46А-В), а также в утолщенных стенках инфекционных нитей,заполненных каллозой (Рисунок 46Д), стенках инфицированных клеток(Рисунок 46Е) и вокруг преждевременно стареющих бактероидов (Рисунок46Д).Рисунок 46.
— Локализация пероксида водорода в симбиотическихклубеньках гороха мутанта RisFixV (Pssym42)(А, Б) последовательные стадии накопления пероксида водорода винфекционной нити от внутренней стенки инфекционной нити (А) спредпочтительным и чрезмерным отложением в матриксе инфекционнойнити (Б). (В) отложение пероксида водорода в матриксе инфекционнойкапли. (Г-Е) пероксид водорода в стенке инфекционной нити (Г) и клеточнойстенке (Е) с накоплением каллозы, а также вокруг стареющих бактероидов(Д). Пероксид водорода откладывается в виде электронно-плотныхпреципитатов пергидроксида церия (показаны стрелками). ин —инфекционная нить, ик — инфекционная капля, син — стенка инфекционнойнити, б — бактерия, ба — бактероид.
Масштабная линейка = 500нм.Результаты и обсуждение272Был проведен анализ пространственной локализации АФК на примерепероксида водорода в клубеньках гороха дикого типа, а также трех мутантов,формирующих неэффективные клубеньки с ярко выраженными защитнымиреакциями (см. раздел 3.11). Было показано, что в клубеньках гороха дикоготипа пероксид водорода был ассоциирован со стенками инфекционных нитейи клеточными стенками, матриксом инфекционных нитей и капель, в то жевремя он не детектировался в симбиосомах. В стареющих клубенькахнаблюдалась аккумуляция пероксида водорода вокруг деградирующихбактероидов, в стенке и матриксе инфекционной нити и матриксеинфекционной капли.
Аналогичное распределение пероксида водороданаблюдалось ранее в клубеньках люцерны, гороха, сои (Santos et al., 2001;Alesandrini et al., 2003; Rubio et al., 2004; Kopcińska, 2009). Отсутствиепероксида водорода в симбиосомах может быть связано с антиоксидантнойсистемой, функционирующей как в инфицированной клетке, так и всимбиосомах (Becana et al., 2010; Ribeiro et al., 2015).В то же время у всех проанализированных мутантов наблюдалисьаномалии в локализации пероксида водорода.
Для мутанта SGEFix−-1(Pssym40) было характерно присутствие пероксида водорода вокругювенильных бактероидов, для RisFixV (Pssym42) — вокруг преждевременностареющих бактероидов, у мутанта SGEFix−-2 (Pssym33) — вокругутолщенных стенок инфекционных нитей. Такое аномальное распределениепероксида, вероятно, связано с активацией в этих мутантах сильныхзащитных реакций (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
