Диссертация (1144724), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Сходный фенотип наблюдался для линий горохаафганского происхождения, несущих аллель Pssym2A (Degenhardt et al., 1976;Geurts et al., 1997) и мутанта DK24 (Pssym36) (Sagan et al., 1994).Таким образом, у гороха, по крайней мере, 3 локуса (PsSym5, PsSym16и PsSym34) контролируют развитие клубенькового примордия и 4 локуса(PsSym2, PsSym36, PsSym37 и PsSym38) необходимы для развитияклубеньковой меристемы.3.3.3. Последовательностьфункционированиясимбиотическихгенов гороха, контролирующих ранние стадии развития клубенькаПроведенная нами фенотипическая характеристика большого набораNod− мутантов гороха позволила классифицировать симбиотические гены всоответствии со стадией развития клубенька, которую они контролируют.Также предложена схема последовательности функционирования раннихсимбиотических генов гороха на основе результатов, полученных в даннойработе, и данных литературы (Рисунок 38).Важно заметить, что мутации по генам Pssym2, Pssym36, Pssym37,Pssym38 вызывают более ранний блок развития инфекционной нити, чеммутации по генам Pssym5, Pssym16 и Pssym34.
Тем не менее, мутации погенам Pssym2, Pssym36, Pssym37, Pssym38 блокируют органогенез клубенькана более поздней стадии, чем мутaции по генам Pssym5, Pssym16 и Pssym34(Рисунок 38). Эти наблюдения позволяют нам предположить, что эти генывовлечены в две различные, но параллельные подпрограммы развитияклубенька. Группа генов Sym2, Sym36, Sym37 и Sym38 контролируютинфекцию тканей клубенька ризобиями, в то время гены второй группыSym5, Sym16 и Sym34 вовлечены контроль органогенеза клубенька. МутантыгорохасфенотипамиIti−Ccd+илиIti+Ccd−небыливыявлены.Представляется, что у гороха рост инфекционной нити не может бытьинициирован до инициации клеточных делений коры и vice versa. Тем неменее, было показано, что у гороха (Libbenga, Harkes, 1973), так же как уРезультаты и обсуждение253Medicago (Dudley et al., 1987; Timmers et al., 1999; Catoira et al., 2001),клеточные деления коры предшествуют инициации инфекции.
Такимобразом, по-видимому, у мутантов по генам Pssym7, Pssym14 и Pssym35прерывание инфекции является результатом неспособности этих мутантовинициировать деления коры корня.Вероятно, что в данном исследовании были выявлены 3 точки контроляинфекции тканей клубенька ризобиями и одна точка контроля подпрограммыорганогенеза клубенька. В случае прерывания органогенеза клубенька напервой стадии — Ccd−, инфекционный процесс может быть остановлен надвух стадиях: (1) после скручивания корневых волосков, но перед ихколонизацией (Crh−) как в случае мутантов по гену Pssym7 и (2) послеколонизации скрученных корневых волосков, но перед стадией инициациироста инфекционной нити (Iti−), как в случае мутантов по генам Pssym14 иPssym35. Таким образом, во время периода инициации делений коры корняимеются две точки контроля инфекционной программы. Существование двухточек контроля может объяснить различия, которые могут наблюдаться вблоках клеточных делений коры корня, вызываемых мутациями в генеPssym7 с одной стороны и мутациями по генам Pssym14 и Pssym35 — сдругой стороны.
Например, возможно, что у мутантов по генам Pssym14 иPssym35 некоторые клеточные деления происходят в клетках перицикла,сходно с таковыми, наблюдаемыми у Medicago (Timmers et al., 1999).Третьей точкой контроля для программы инфекции является развитиепримордия. У гороха были выявлены два блока развития клубеньковогопримордия: после нескольких делений коры корня в случае мутаций по генамPssym5 (Guinel, LaRue, 1991) и Pssym34 (данное исследование) и послеформирования «плоского» примордия в случае мутации по гену Pssym16(Guinel, Sloetjes, 2000).
На этой третьей точке контроля инфекционныйпроцесс прерывается на последовательных стадиях роста инфекционной нитивнутри клеток коры: мутация по гену Pssym16 ведет к блоку ростаРезультаты и обсуждение254инфекционной нити на более поздней стадии внутри коры корня, чеммутации по генам Pssym5 и Pssym34.Представляется, что выявлена только одна точка контроля дляорганогенеза, которая включает рост инфекционной нити в эпидерме. Вслучае, когда рост инфекционной нити в корневом волоске прерывается,органогенез клубенька останавливается после развития клубеньковогопримордия и перед формированием клубеньковой меристемы.
Тем не менее,в случае успешной инфекции растений, гомозиготных по аллели Pssym2A(Geurts et al., 1997) и у мутанта RisNod4 (Pssym37) (данное исследование),которые иногда происходят, формируются нормальные азотфиксирующиеклубеньки. Эта ситуация находится в противоречии с результатами,полученными для Medicago, где меристема формируется даже в случаенеуспешного роста инфекционной нити (Leigh et al., 1985; Yang et al., 1992;Timmers et al., 1999). Эти различия могут объясняться различиями вмеханизмах контроля со стороны растения над развитием клубенька у разныхвидов. Такого рода различия уже были описаны для Medicago и Pisum(Timmers et al., 1999).
Существование такого рода различий, особенно вразвитиимеристемыможетбытьподдержанотемфактом,чтопсевдоклубеньки (клубенек-подобные структуры), формируемые на корнях вотсутствии инокуляции ризобиями, были описаны для Medicago (Truchet etal., 1989), но не для гороха. Очевидно, что наша классификация,базирующаяся на логике формального генетического анализа, относительна.Тем не менее, она может быть полезной для молекулярно-генетическихисследований (Dolgikh et al., 2011).Результаты и обсуждение255Рисунок 38. — Схема последовательности функционированиясимбиотических генов гороха, вовлеченных в генетический контрольинфекции и органогенеза клубенькаПроцесс инфекции и органогенез клубенька искусственно разделен на 2подпрограммы развития. Рисунки с последовательными стадиямиподпрограммы инфекции корня ризобиями помещены с левой сторонырисунка и соединены голубыми стрелками (клетки растений обозначеныжелтым цветом, бактерии — голубым).
Рисунки последовательных стадийподпрограммы органогенеза клубенька связаны оранжевыми стрелками иРезультаты и обсуждение256помещены на правой стороне (клетки коры корня обозначены желтымцветом, делящиеся клетки — оранжевым, клетки перицикла обозначеныутолщенными клеточными стенками, клетки меристемы — красным цветом).Гены, контролирующие различные стадии развития клубенька помещены вцентр рисунка. Гены, контролирующие инфекционный процесс, ифенотипические коды, соответствующие стадиям его развития обозначеныголубым. Гены, контролирующие органогенез клубенька, и фенотипическиекоды, соответствующие стадиям его развития, обозначены оранжевым, гены,вовлеченные в оба процесса — зеленым. Возможные блоки развитиямаркированы перекрестием и стрелками от гена или группы генов,контролирующих соответствующую стадию.
Стрелки от генов к стадиямокрашены цветом, соответствующим процессу, (голубой для инфекционногопроцесса и оранжевый для органогенеза). 3 точки проверки регуляторнойобратной связи между двумя процессами и стрелки, показывающиепредполагаемые связи между ними, маркированы следующим образом: отподпрограммы органогенеза — пурпурным цветом (номера 1, 2 и 3 того жецвета) и от подпрограммы инфекции — фиолетовым цветом (номер 1 того жецвета) (Tsyganov et al., 2002).3.4. Идентификация гена гороха, ортологичного гену лядвенцаLjNIN, являющегося первым клонированным геном бобовых растений иключевым регулятором симбиогенеза на ранних стадиях.Как было отмечено в предыдущем разделе, мутанты по гену Pssym35характеризовались наибольшим фенотипическим сходством с мутантами погену Ljnin: у них не индуцировались клеточные деления во внутренних слояхкоры и наблюдалось сильно увеличенное, по сравнению с диким типом,число скрученных волосков.
Это позволило считать ген PsSym35 наиболеевероятным кандидатом на роль ортолога гена LjNin.Для выявления гена PsNin в лаборатории Йенса Стоугаарда (Орхускийуниверситет)былиспользованиемизолированвырожденных2500п.н.праймеров,фрагментгенасозданныхPsNinнасосновеконсервативных последовательностей у генов LjNin и гомологичного гена уA. thaliana. Данный ген был локализован в I группе сцепления гороха.В генной библиотеке, «обогащенной кДНК корневых волосков», былиидентифицированы 4 клона с фрагментами искомого гена: RH1, RH2, RH3 иРезультаты и обсуждение257RH4, которые после очистки были получены на бактериальных плазмидахпосле «вырезания in vivo» фагмиды, проведенного в соответствии спротоколом фирмы STRATAGENE (“In vivo excision protocol for UNI-ZAPXR vectors” to subclone the inserts in bacteria (vector pBluescript SK (+/-)”).Последующеепроведеновсеквенированиесоответствиисвыделенныхпротоколом фирмыфрагментовAMERSHAMбылодляавтоматического секвенирования (AMERSHAM Thermo Sequenase DyeTerminatorCycleSequencing)исиспользованиемпраймеровдлясеквенирования вставки в pBluescript SK (+/-) векторе «с концов», а такжевновь синтезированных праймеров для продолжения секвенированияклонированного фрагмента.
В результате секвенирования фрагмента G2 изгеномной библиотеки была получена структура участка в 8000 п.о.,включающего структурный и промоторный (приблизительно 3000 п.о.)районы изучаемого гена. Вначале был секвенирован данный район генотипаАляска (геномная библиотека на основе фага лямбда была создана сиспользованием этого генотипа). Далее праймеры, использованные длясеквенирования аллельного варианта изучаемого гена генотипа Аляска, былииспользованы для секвенирования аллельных вариантов генотипов SGE иFinale, так как именно на этих генотипах были получены независимыемутанты по гену Pssym35, и это было необходимо для дальнейшегосеквенирования мутантных аллелей и доказательства идентичности генагороха PsSym35 гену PsNin.Для подтверждения этой гипотезы была проведена локализация генаPssym35 на генетической карте гороха.
Были проанализировано расщеплениепо серии морфологических маркеров и симбиотическому признаку впоколениях F2 и F3 от скрещивания линий SGENod−-3 и NGB1238. Врезультате было показано слабое сцепление с Pssym35 с маркером I группысцепления гороха d. На данном плече хромосомы, соответствующей даннойгруппе сцепления, располагается и ген PsNin. В дальнейшем был проведенкосегрегационный анализ между PsNin и Pssym35. На основе полиморфизмаРезультаты и обсуждение258по гену PsNin между линиями NGB1238 и SGENod−-3 были созданы аллельспецифичные праймеры, позволяющие получить различающиеся продуктыамплификации гена PsNin у данных линий. С использованием данныхпраймеров было показано, что 121 растение — доминантные гомозиготыPsSym35 и 149 растений рецессивных гомозигот Pssym35 показали 100%косегрегацию Sym35 и PsNin.Таким образом, аллели дикого типа гена PsNin были секвенированы утрех различных генотипов гороха.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
