Диссертация (1144724), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Определение содержания эндогенного ауксинаБыли отобраны ранжированные семена (от 130 до 139 мг сухого веса).2-х недельные корни асептических проростков были использованы дляэкстракции ИУК. Экстракция ИУК проводилоась согласно (Kravchenko et al.,1994). Образцы (1,5-4 г) были растерты в жидком азоте и экстрагированы50 мл 80% этанола.
После фильтрации и роторного испарения при 45 °C,образцы были дважды экстрагированы этилацетатом, подкисленным 2N HClдо pH 2–3. Конечные экстракты были выпарены до сухого остатка,растворены в 3 мл 10% ацетонитрила и пропущены через колонку OctadecylС18 (J.T. Baker, Inc., Нидерланды). Колонка была промыта 3 мл 10%ацетонитрила, затем ИУК элюировали 3 мл 50%-го раствора ацетонитрилапри скорости элюирования 1 мл/мин. Элюат был высушен, затем растворен в1 мл 10%-го раствора ацетонитрила.
Такие образцы были использованы дляопределения содержания ИУК.Образцы объемом 100 мкл были проанализированы с использованиемприбора ХЖ 1311 (КБ Аналитического приборостроения, Россия) сфлуориметрическим детектором при длине волны 285 нм. Колонку размером340 x 0.5 мм заполнял сорбент Nucleosil C18 (Sigma-Aldrich, США) счастицами диаметром 10 мкм. Объем пробы составлял 100 мкл. В качествемобильной фазы использовался 30%-ый раствор ацетонитрила.
Скоростьэлюции составляла 12,4 мкл/мин. В виде стандарта использовали чистуюИУК (Serva, Германия). 1 мг ИУК растворяли в 1 мл 10%-го раствораацетонитрила, затем разводили до 100 нг/мл с помощью 1N HClO4.2.6.3. ОпределениечувствительностиклубенькообразованиякэтиленуДля оценки влияния этилена на клубенькообразование у мутантов былииспользованы ингибитор действия этилена (ионы серебра), ингибиторсинтеза этилена (аминоэтоксивинилглицин), вещество, выделяющее этиленМатериалы и методики211— 2-хлорэтилфософоновая кислота (этефон), предшественник этилена в егобиосинтезе(1-аминоциклопропан-1-карбоноваяпитательныйрастворданныереагентыкислотадобавлялись(АЦК)).вВколичестве,необходимом для достижения конечной концентрации 10 мкМ.
Обработкиповторялись через каждые 3 дня в течение всего срока выращиваниярастений — 4 недели.Вовремясъемаэкспериментабылипроанализированытакиепараметры как, число клубеньков, вес клубеньков, вес 1 клубенька, вескорней и вес стеблей.2.7. Методика определения содержания кадмияДля анализа содержания кадмия в побегах, корнях и клубенькахрастения были выращены в условиях гидропоники с добавлением 0,5 мкМхлорида кадмия.
Затем корни растений были трижды по 10 мин промыты в10 мМ ЭДТА, затем дважды промыты дистиллированной водой и разделенына побеги, корни и клубеньки и высушены при комнатной температуре втечение недели. Затем части растений были взвешены и гомогенизированы.Определениеэлементовпроводилосьметодоммасс-спектрометриисиндуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) на приборе «Agilent 7700» фирмы«Agilent Technologies», США.2.8. Статистическая обработка результатовСоответствие реальных расщеплений в поколении F2 с теоретическимрассчитывали с помощью критерия χ2.Результаты экспериментов по анализу уровней транскриптов былиобработаныспомощьюпрограммыMicrosoftдисперсионногоExcel.анализаСтатистическисиспользованиемдостоверныеопределялись с использованием критерия Даннетта и t-критерия.различияМатериалы и методикиСтатистическипараметров,212достоверныевлиянияклубенькообразования,различияразличныханализечислаприсравненииростовыхнапараметрыобработокинфекцийиформирующихсяпримордиев, количественном анализе экспрессии бактериальных генов,количестве культивируемых из клубеньков бактерий проводили с помощьюt-критерия Стьюдента.Статистически достоверные различия в распределения частиц золота встенках инфекционных нитей в клубеньках линий дикого типа и мутантныхлиний проводился с помощью критерия Тьюки.Глава 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Выделение симбиотических мутантовВ ходе скрининга мутантов по симбиотическим признакам былопроанализировано 425 семей (2069 растений) поколения М2. При визуальномосмотре корневых систем растений было выявлено, что большинстворастений формировали крупные розовые клубеньки, характерные дляисходной линии SGE. В то же время наблюдались растения с различнымиотклонениями от фенотипа клубеньков исходной линии.
Были выявлены 13потенциальных мутантов, неспособных формировать клубеньки (фенотипNod−), и 2 потенциальных мутанта, формирующих единичные клубеньки(фенотип Nod+/−) (Таблица 10). Кроме того, были обнаружены 30потенциальныхмутантов,формирующихнеэффективныеклубеньки(фенотип Fix−). Последний класс мутантов был представлен растениями сразличными аномалиями в окраске клубеньков (Таблица 10). Не от всехвыявленных потенциальных мутантов M2 были получены семена М3.Поэтому дальнейший скрининг мутантов, от которых не удалось получитьсемена M3, был продолжен для растений М3, полученных от родственныхпотенциальным мутантам растений.Большинство выявленных потенциальных мутантов были размноженыдо поколения M5, после чего был проведен повторный анализ фенотиповформируемых на корнях растений клубеньков (Таблица 10).
Некоторыепотенциальные мутанты не подтвердили мутантный фенотип — это линииSGE-215, SGE-219, SGE-241, SGE-276, SGE-305. Для первоначальновыделенного по признакам Fix− мутанта SGE-330 позднее был показанфенотип Nod−.Таблица 10. Характеристика симбиотических мутантов, полученных ЭМС-мутагенезом на линии SGEКоличество растений в семье М2без аномалий клубеньковКоличество потенциальныхмутантов в семье М2, фенотип ихклубеньковПолучены ли семена М3Локус№ семьи в М2Названиемутантнойлинии,созданнойпосле селекциисегреганта смутантнымфенотипом изF2 отскрещиваниямутанта сисходнойлиниейАнализродственныхрастений впоколении М311831, мелкиерозовыенетмутациявыявленаутерян––251101, белыенетмутациявыявленаутерян––да–малочисленныебелые с ямкойSGEFix−–5Pssym33№Фенотипклубеньковв М5310333, белые сямкой накончике411441, белыенетмутациявыявленаутерян––515141, белыенетмутациявыявленаутерян––67Результаты и обсуждение1, бледно1643розовые19241, розовозеленые215нетмутация невыявлена–––да–розово-зеленыеSGEFix−–9–––820532, розовозеленыеда–многочисленныемелкие белые и10–15 крупныхрозовых921151, розовозеленыенетмутация невыявлена–––1021521, розовозеленыеда–розовые––1121922, розовозеленыеда–розовые––1223761, белыедамутациявыявленаутерян––1324021, розовозеленыенетмутациявыявленаутерян––1424172, белыенет–розовые––15243101, бледнорозовыенетмутация невыявлена–––1624731, яркозеленыеда–утерян––17Результаты и обсуждение1, мелкие и24918крупныебелыеда–216мелкие и крупныебелые и бледнорозовыеSGEFix−–6Pssym401925231, яркозеленыеда–розовые и яркозеленые––19258141, розовозеленыедамутация невыявленаутерян––2026841, розовозеленыеда–бело-зеленыеSGEFix−–8Pssym252127542, розовозеленыеда–утерян––2227691, розовозеленыеда–розовые––23279153, белозеленыеда–бело-зеленые––24282141.
белозеленыенетмутациявыявленаутерян––25305111, розовозеленыеда–розовые––26317121, розовозеленыедамутация невыявленаутерян––27330201, несколькобелыхда–нет клубеньковSGENod−–9–28Результаты и обсуждение2, розово3596зеленые217да–розово-зеленые––29385161, розовозеленыедамутация невыявленаутерян––3040362, розовозеленыеда–розово-зеленыеSGEFix−–7Pssym27313271, нетклубеньковда–нет клубеньков––323351, нетклубеньковнет––––337311, нетклубеньковнет––––348651 несколькоклубеньковда–несколькоклубеньков3510441, нетклубеньковдамутациявыявленаутерян––3614851, нетклубеньковда–нет клубеньков––3715881 несколькоклубеньковда–несколькоклубеньков––3818331, нетклубеньковдамутациявыявленаутерян––39Результаты и обсуждение2, нет2124клубеньков218дамутациявыявленанет клубеньков––40290131, нетклубеньковда–нет клубеньков––4129391, нетклубеньковнетмутациявыявленанет клубеньков––42328132, нетклубеньковда–утерян––4334161, нетклубеньковда–утерян––4435281, нетклубеньковдамутациявыявленаутерян––4535751, нетклубеньковдамутациявыявленанет клубеньков––3.2.
Генетический анализ3.2.1. Гибридологический анализВ гибридологический анализ были вовлечены потомки потенциальныхмутантов из семей М2 — мутантные растения поколения М5, показавшиестабильность проявления мутантного фенотипа в ряду 3-х поколений.Для мутанта SGE-330 было показано моногенное наследование ирецессивное проявление признака неспособности к клубенькообразованию(Таблица 11).Для Fix− мутантов SGE-103, SGE-249, SGE-268 и SGE-403 былопоказано моногенное наследование и рецессивное проявление признакаформирования неэффективных симбиотических клубеньков (Таблица 12).
Умутанта SGE–192 были выявлены 2 мутации в двух несцепленныхсимбиотическихгенах,однаизкоторыхопределяетобразованиеуменьшенного количества клубеньков (Nod+/− фенотип), а другая —формирование неэффективных клубеньков (Fix− фенотип) (Таблица 13).При анализе расщепления F2 от скрещивания мутантов с исходнойлинией были отобраны сегреганты с проявлением мутантных фенотипов, наоснове которых после селекции в ряду пяти поколений были созданымутантные линии SGENod−–9, SGEFix−–5, SGEFix−–6, SGEFix−–7, SGEFix−–8и SGEFix−–9 (Таблица 10).3.2.2.
Комплементационный анализВ комплементационныйанализ быливключеныкакмутанты,полученные в ходе предыдущей программы по экспериментальномумутагенезу (Tsyganov et al., 1994), так и полученные в ходе данной работы.В ходе комплементационного анализа Nod− мутантов растения линийSGENod−–1, SGENod−–2, SGENod−–3, SGENod−–4, SGENod−–6 и SGENod−–8были скрещены с типовыми линиями, представляющими симбиотическиеРезультаты и обсуждение220гены, контролирующие ранние стадии клубенькообразования. Проведенныйанализ позволил отнести шесть изученных мутантных линий к четыремгруппам комплементации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
