Диссертация (1144724), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Анализ развития примордиев клубенькаАнализ последовательных стадий развития симбиотического клубенькау Nod− мутантов проводился на 15-й, 23-й и 28-й ДПИ. На каждом из сроковбыло проанализировано по 5 растений. С помощью вибрационногомикротома VT 1000S (Leica Microsystems, Германия) были получены 70 мкмсрезы главных корней. Срезы были окрашены в растворе, позволяющемвизуализировать присутствие фермента β-глюкуронидазы (см.
раздел 2.4.5.),в течение 1 ч. Затем срезы были фиксированы в течение 1 ч в 1,25%-номрастворе глутаральдегида, приготовленного на основе 0,1 M Na-фосфатногобуфера. Тщательно промытые дистиллированной водой срезы былипомещены на предметные стекла и проанализированы с помощью световогомикроскопа Olympus BX50 (Olympus, Германия). Сравнение распределенийпо количеству клубеньковых примордиев, наблюдаемых у растенийразличных линий, проводили с помощью критерия χ2.2.4.6. Анализ экспрессии бактериальных геновАнализ экспрессии бактериальных генов в клубеньках Fix− мутантов идикого типа проводился на 28-й день после инокуляции.
С цельюинактивации β-галактозидазы растений, клубеньки, образованные штаммамиR. leguminosarum bv. viciae, несущими слияния с репортерным геном lacZ,были помещены в 0,1 M Na-фосфатный буфер, а затем в 1,25%-ный растворглутаральдегида и выдержаны под вакуумом, в течение 30 и 45 мин,соответственно.Материалы и методики187Срезы клубеньков были получены, как описано выше. Окраска срезовклубеньков, образованных штаммами, несущими репортерные слияния сгеном lacZ проводилась в растворе, содержащим 0,02% 5-бромо-4-хлоро-3индолил-β-D-галактопиранозида (X-gаl) вместо 0,02% 5-бромо-4-хлоро-3индолил-β-D-глюкуроновой кислоты (X-glc).Окраска срезов клубеньков, образованных штаммами VF39 nodA-lacZ,VF39 dctA-lacZ и VF39 dctA-gusA, проводилась в течение 1 ч; штаммамиVF39 fnrN-gusA, VF39 nifA-gusA и VF39 fixN-gusA — в течение 18 ч.2.4.7.
Световая микроскопияИсследования проводили с помощью микроскопов: Opton Axiovert-35(Carl Zeiss, Германия), Olympus BX50 и камеры Olympus Om-4 (Olympus,Германия), AxioImagerZ1 (Carl Zeiss, Германия) и цифровых камерColorViewII (Olympus, Германия) и AxioCam506 (Carl Zeiss, Германия).2.4.8. Лазерная конфокальная сканирующая микроскопияИсследованияпроводилиспомощьюлазерныхсканирующихконфокальных микроскопов LSM510 META и LSM780 (Carl Zeiss,Германия). 3D реконструкции и проекции максимальной интенсивностиоптических срезов были получены с использованием программногообеспечения ZEN2009 и ZEN2012 (Carl Zeiss, Германия).2.4.9. Электронная микроскопияТкани клубеньков были исследованы и сфотографированы напросвечивающем электронном микроскопе JEM-1200 EM и JEM-1400 STEM(Jeol, Япония) с цифровой камерой Olympus-SIS Veleta (Olympus, Япония)при ускоряющем напряжении 80 кВ.Материалы и методики1882.5.
Молекулярно-биологические методики2.5.1. Выделение растительной ДНКВыделение ДНК проводили с использованием DNeasy 96 Plant Kitсогласно протоколу фирмы-производителя (Qiagen, Германия).2.5.2. Выделение геномной ДНК бактерийВ микроцентрифужную пробирку вносили 20 мкл лизирующего раствора(25 мМ NaOH, 0,25% SDS), добавляли 2 мкл бактериальной культуры ивыдерживали смесь 5 мин при 95 °С.
Затем в пробирку добавляли 180 мклстерильной деионизированной воды и замораживали пробы (-80 °С, 10 мин).После разморозки при комнатной температуре пробы центрифугировали(2 мин, 13000 g). Полученные лизаты хранили при температуре −20 °С.2.5.3. Выделение плазмидной ДНККультуру бактерий, выращенную на твердой среде LB с добавлениемсоответствующего антибиотика, помещали в жидкую среду LB и в течение30 мин суспензию клеток перемешивали на микроцентрифуге-вортексVortex-Genie 2(ScientificIndustries,США).Затемклеткиосаждалицентрифугированием (1 мин, 13000 g), осадок ресуспендировали в 100 мклTE буфера (10 мМ Tрис-HCI, 5 мМ ЭДТА, рН 8,0) и, добавив 5 мкл РНКазы(20 мкг/мкл) и 200 мкл свежеприготовленного лизирующего раствора (0,2 НNaOH, 1% SDS), осторожно перемешивали полученную суспезию ивыдерживали 5 мин при комнатной температуре. После чего в каждую пробудобавляли 150 мкл 3 М раствора ацетата калия (рН 4,8) и интенсивноперемешивалидопоявлениябелоготворожистогоосадка.Пробыцентрифугировали (10 мин, 14000 g) и прозрачный супернатант переносили вновые микроцентрифужные пробирки.
Затем проводили очистку ДНК отбелковых примесей однократной экстракцией смесью фенол-хлороформ(1 : 1) (добавляли 350 мкл смеси; центрифугировали 10 мин, 14000 g;Материалы и методики189верхнюю водную фазу отбирали в новую пробирку)и однократнойэкстракцией смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24 : 1) (добавляли350 мкл смеси; центрифугировали 10 мин, 14000 g; верхнюю водную фазуотбирали в новую пробирку). После чего ДНК осаждали из водной смесидвумяобъемами96%этанола5 минприкомнатнойтемпературе,центрифугировали пробы (5 мин, 14000 g) и удаляли супернатант.
Осадокпромывали 250 мкл 70% этанола, снова центрифугировали (5 мин, 14000 g) иполностью удаляли супернатант. Затем осадок подсушивали до испаренияэтанола и растворяли в стерильной деионизированной воде. Растворы ДНКхранили при −20 °С.2.5.4. Рестрикция ДНК с помощью эндонуклеазРестрикцию ДНК проводили в 20-30 мкл инкубационной смеси, в составкоторой входили: 50-300 нг выделенной ДНК, 10 единиц активностифермента рестрикции и соответствующий буфер для работы фермента.Реакциюпроводилипритемпературе37 °Свтечение12-16ч.Рестрицированную ДНК хранили при −20 °С.2.5.5.
Лигирование ДНКВ работе проводили три типа лигирования: (1) лигирование двухфрагментов ДНК по тупым концам в течение 12-20 ч при 18 °С; (2)лигирование фрагмента ДНК и линеаризованного вектора по липким концамв течение 12-20 ч при 18 °С; (3) лигирование фрагмента ДНК и вектора pALTA- А/Т клонирование, в течение 1-4 ч при комнатной температуре.Лигирование ДНК проводили в 20 мкл лигазной смеси, содержащей 5 единицВейса лигазы фага T4 (5 ед/мкл, MBI Fermentas, Литва), АТФ-содержащийбуфер для работы лигазы (MBI Fermentas, Литва) и соответствующиефрагменты ДНК (20-100 нг) и векторы (10-50 нг). Лигированные фрагментыДНК хранили при −20 °С.Материалы и методики1902.5.6.
Векторы для клонирования.Был использован вектор pAL-TA (Евроген, Россия). Вектор создан наоснове pUC плазмиды и позволяет напрямую (без предварительнойобработкиферментамирестрикции)клонироватьфрагментыДНК,амплифицированные с помощью Taq-полимеразы. В свою очередь, Т-векторпредставляет собой линейную молекулу плазмидной ДНК, обработаннуюрестриктазой, дающей «тупые» концы, и содержащей дидезокситимидин(ddT) на 3'-конце обеих цепей. При последующем лигировании с Т-векторомПЦР-фрагментвключаетсявсоставплазмидыпопринципукомплементарности. Трансформированные белые колонии отбирались насреде LB с ампициллином (100 мг/л) и X-Gal.
Проверка наличияинтересующей вставки определялась методом ПЦР.Так же был использован вектор pCAMBIA 0390 (Cambia, Австралия)(Рисунок 33). Вектор содержит полилинкер плазмиды pUC9, что позволяетвстраивать в него интересующие фрагменты ДНК по сайтам рестрикции, атакже несет ген устойчивости к канамицину.
Трансформированные колонииотбирались на среде LB с канамицином (100 мг/л). Проверка наличияинтересующей вставки определялась методом ПЦР.Материалы и методики191Рисунок 33. — Карта рестрикции вектора pCAMBIA 03902.5.7. Трансформация и конъюгация бактерий.Приготовление компетентных клеток E. coli проводили по методу,описанному Иноу с соват. (Inoue et al., 1990). 100 мкл размороженныхкомпетентныхклетоквносиливохлажденныемикроцентрифужныепробирки, добавляли 1-50 нг плазмидной ДНК или лигазной смеси ивыдерживали на льду 30 мин. Затем проводили тепловой шок притемпературе 42 °С в течение 30 сек и охлаждали 5 мин на льду.
После чегодобавляли 1 мл среды SOB и подращивали клетки при температуре 37 °С втечение 45-60 мин. Затем клетки высевали на среду LB, содержащуюантибиотик, соответствующий плазмидному маркеру. Для выявлениятрансформантов Lac− штаммов E. coli, содержащих векторные плазмиды совставкой, в среду добавляли X-Gal (20 мг/л) и IPTG (10 мг/л).СуспензияклетокE.coliштаммаS17,предварительнотрансформированных плазмидой pCAMBIA, несущей интересующий ген,Материалы и методики192смешивали с суспензией клеток R. leguminosarum bv. viceae 3841 всоотношении 1 : 5. Смесь клеток высевали каплями на твердую среду TY безантибиотика. Клетки культивировали в течение 4-х суток при температуре28 °С и рассевали смесь клеток ризобий и E.
coli истончающимся штрихом насреду TY со стрептомицином 500 мг/л (маркер реципиента) и канамицином100 мг/л (маркер плазмиды). Через 4-6 дней после посева появившиесяколонии R. leguminosarum анализировали на наличие интересующей вставкиметодом стандартной ПЦР.2.5.8. ПЦРПЦР проводилась с использованием амплификатора PTC-200 ThermoCycler (MJ Research, США). Реакционная смесь содержала 2,5 мМ MgCl2,0,125 мМ каждого из дезоксирибонуклеотидов, 1 единицу Taq-полимеразы(Invitrogen, США) и 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров. Объемреакционнойсмесисоставлял20 мкл.УсловияпроведенияПЦР(оптимизировались для каждой пары используемых праймеров): начальнаяденатурация ДНК (94 °С — 5 мин), 30 циклов амплификации: денатурация(94 °С — 30 сек), отжиг праймеров (температура отжига праймеровподбиралась на основе свойств пары конкретных олигонуклеотидов впрограмме Primer Select и варьировала в пределах 54-60 °С — 30 сек), синтезДНК (72 °С — 40 сек), окончание синтеза ДНК (72 °С — 10 мин).Фрагментыамплификацииипродуктырестрикцииразделялиэлектрофоретически в 1,5% агарозном геле в 0,5-кратном трис-ацетатномбуфере и регистрировали с помощью системы Gell Doc ХR System (BioRad,США).2.5.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
