Диссертация (1144724), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Методика иммунолокализации для световой и лазернойсканирующей конфокальной микроскопииДля проведения иммунолокализации были модифицированы ранееиспользованные методики (Baluška et al., 1992; Stumpe et al., 2006). СерийныеМатериалы и методики181срезы толщиной 16 мкм приготовляли с помощью ротационного микротомаHM 360 (Microm, Германия). Срезы были помещены на силанизированныестекла,покрытыеяичнымбелком,ирасправленыдобавлениемдистиллированной воды.
Удаление заливочной среды проводилось путемтрехкратной обработки в 96% этаноле в течение 10 мин, с последующими 10мин обработками 70% этанолом, 40% этанолом и завершающей двукратнойинкубацией в 1/3 концентрации MTSB в течение 15 мин. Для блокированиянеспецифического связывания срезы инкубировали в блокирующем растворе(5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,5% сыворотка козы, 0,2%желатин холодноводных рыб (cold fish skin gelatin) в 1/3 концентрацииMTSB) в течение 30 мин при 28 °C, затем в растворе ацетилированного BSA(2мг/мл) в буфере TBS (50мМ TrisHCl, 150мМ NaCl, pH 7,5) в течение 30 минпри 28 °C. Затем срезы инкубировали в растворе первичных антител в 1%BSA в TBS в течение ночи при 4 °C. Срезы промывали 5 раз по 10 мин вбуфере TBS, блокировали в 5% растворе BSA в TBS при 28 °C.
Затеминкубировали с вторичными антителами при 28 °C в течение 90 мин. Далеесрезы промывали в буфере TBS 3 раза по 10 мин, окрашивали йодидомпропидия (0,5 мкг мл−1) в течение 7 мин для визуализации ядер и бактерий.Срезы промывали в буфере TBS 3 раза по 10 мин и помещали на предметноестекло в заключающую среду ProLong Gold® antifade reagent (Thermo FisherScientific, США).2.4.3.2. МетодикаиммунолокализациидляэлектронноймикроскопииДля просвечивающей электронной микроскопии ультратонкие срезы(90-100 нм) собирали на золотые сеточки, покрытые 4%-ным растворомпироксилина и углеродом.
После блокирования в 50 мМ растворе глицина вPBS в течение 15 мин и в блокирующем буфере ABB (5% BSA, 0,1%желатина кожи холодноводных рыб, 5-10% нормальной козьей сыворотки,Материалы и методики18215 мМ NaN3 в PBS, рН 7,4; Aurion, Нидерланды) в течение 30 мин, срезынесколько раз промывали в 0,1%-ном растворе BSA-C (Aurion, Нидерланды)в PBS и инкубировали с первичными антителами в разведении 1 : 50 или1 : 100 в 0,1%-ном растворе BSA-C в течение ночи при 4 °С. Послепромывания в 0,1%-ном растворе BSA-C срезы инкубировали со вторичнымикозьимиантителамиккрысиному(кроличьему)гамма-глобулину,конъюгированными с коллоидными золотом (размер частиц 10 нм; AmershamInternational, Великобритания), в разведении 1 : 50 в 0,1%-ном растворе BSAC в PBS в течение 4 ч при комнатной температуре. После промываниясеточек в буфере PBS в течение 20 мин и затем в деионизированной воде втечение30 минсрезыконтрастировали2%-нымводнымрастворомуранилацетата в течение 1 ч и цитратом свинца в течение 1 мин.2.4.3.3.
Использованные антителаДля проведения иммунолокализации использовали набор первичных ивторичных антител (Таблица 2)Таблица 2. Используемые в работе антителаАнтителоИспользуемоеразведениеПроизводительмоноклональные мышиные антителак тубулину клон DM1A1:1000Sigma-Aldrich,СШАмоноклональные крысиные антителаМАС571:50Центр ДжонаИннеса (Норвич,Великобритания)моноклональные крысиные антителаМАС2651:50,Центр ДжонаИннеса (Норвич,Великобритания)1:100моноклональные крысиные антителаJIM51:100Plant Probes,Великобританияполиклональные кроличьи антитела кMtSYMREM11:1000Eurogentec, БельгияМатериалы и методики183поликлональные кроличьи антитела к1-аминоциклопропан-1-карбоновойкислоте1:100Agrisera, Швециявторичные козьи антитела ккрысиному гамма-глобулину,конъюгированные сфлуоресцеинизотиоцианатом1:100Molecular Probes,Нидерландывторичные козьи антитела кмышиному гамма-глобулину,конъюгированные с Alexa Fluor 4881:500Thermo FisherScientific, СШАвторичные козьи антитела ккрысиному гамма-глобулину,конъюгированные с Alexa Fluor 5461:500Thermo FisherScientific, СШАвторичные козьи антитела ккрысиному гамма-глобулину,конъюгированные с Alexa Fluor 6331:500Thermo FisherScientific, СШАвторичные козьи антитела ккроличьему гамма-глобулину,конъюгированные с Alexa Fluor 4881:300Thermo FisherScientific, СШАвторичные козьи антитела ккрысиному гамма-глобулину,конъюгированные с 10 нм частицамиколлоидного золота1:50AmershamInternational,Великобритания2.4.3.4.
Количественный анализ распределения частиц золота,конъюгированных с вторичными антителамиДля количественного анализа были проверены, по крайней мере, 5различных образцов клубеньков и по крайней мере 20 секций стенокинфекционных нитей. Морфометрический анализ был проведен, как описаноранее (Fernandez-García et al., 2009). Было проверено, по крайней мере, 3области среза стенки для каждой инфекционной нити, в которых былоподсчитано число частиц золота.
Области и число частиц золота былиизмеренысиспользованиемпрограммногообеспеченияColorViewIIAnalySIS ® (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Германия). Данные былиМатериалы и методики184представлены как число золотых частиц/мкм2. Полученные средние значениябыли сравнены с использованием критерия Тьюки (P≤0,001).2.4.4. Методики гистохимического и цитохимического анализа2.4.4.1.
Методика гистохимического выявления суберинаДля выявления отложений суберина срезы были промыты в буфере TBS2 раза по 10 мин. Далее они были окрашены толуидиновым синим (0,5% вTBS) в течение 45 мин, промыты в буфере TBS (3 раза по 10 мин) иокрашены 0,1%-ным нейтрального красного в 0,1 М K2PO4 (pH 6,5) в течение1 мин, промыты 3 раза по 10 мин буффером TBS и помещены на предметноестекло в заключающую среду ProLong Gold® antifade reagent (Thermo FisherScientific, США). Нейтральный красный является специфичным длявыявления гидрофобных липидных доменов суберина (Lulai, Morgan, 1992).2.4.4.2.
Методика гистохимического выявления каллозыДля выявления отложений каллозы срезы были промыты дважды втечение 10 мин 0,1 М K-фосфатным буфером (pH 8,0) и окрашены 0,1%-ныманлинового синего в K-фосфатном буфере (pH 8,0) в течение 60 мин,промыты 3 раза по 10 мин K-фосфатным буфером (Currier, Strugger, 1956) ипомещены на предметное стекло в заключающую среду ProLong Gold®antifade reagent (Thermo Fisher Scientific, США).2.4.4.3. Методика цитохимического выявления пероксида водородаПосле сбора клубеньки были немедленно погружены в 10 мM растворхлоридацерия(CeCl3)в50 мMраствореMOPS(3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота) (pH 7,0) на 1 ч в вакууме передфиксацией в 2,5%-ном глутаральдегиде (Sigma-Aldrich, США) в 0,1 Mкакодилатном буфере (рН 7,2).
Клубеньки, обработанные и не обработанные(негативный контроль) хлоридом церия, были дополнительно зафиксированыв течение 1 ч в 1% водном растворе четырехокиси осмия в 0,1 MМатериалы и методики185какодилатном буфере, затем были дегидратированы в серии спиртоввозрастающей концентрации (30, 50, 70, 80, 90% и 100% по 20 мин в каждой)при комнатной температуре. Далее образцы были перенесены в 100% ацетонна 20 мин и в смеси ацетона и смолы в соотношении 1 : 1, 1 : 2 и 1 : 3 по 1 ч,затем заключены в эпон при 60 ºС в течение 48 ч. Ультратонкие срезы (90–100 нм) контрастированы 2%-ным водным раствором уранилацетата втечение 10 мин и дополнительно контрастированы раствором цитрата свинцапо Рейнольдсу в течение 5 мин.
Пероксид водорода был локализован какэлектронно-плотный преципитат пергидроксида церия (Bestwick et al., 1997).2.4.5. Визуализация бактерийДлявизуализациибактерийприинокуляцииштаммомR.leguminosarum bv. viciae VF39 gusAconst участки корней были помещены на 18ч в 50 мМ Na-фосфатный буфер pH 7,0, содержащий 0,1% Тритона, 5 мМK3Fe(CN6), 5 мМ K4Fe(CN6) и 0,02% 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-Dглюкуроновой кислоты (X-glc).
Присутствие бактерий определялось подмикроскопом по появлению характерного синего окрашивания.2.4.6. Анализ инфекции корнейАнализ развития инфекции корней у Nod− мутантов проводился на 5-й,9-й, 15-й и 23-й день после инокуляции (ДПИ). Для анализа было взято по 5боковых корней с 5-ти растений, растущих на расстоянии 2-3 см отсемядолей. Участки корней, расположенные на расстоянии 4-8 см от кончикакорня, были окрашены в 0,01%-ном растворе метиленового синего в течение3-4 мин. Окрашенные корни были помешены на предметные стекла ипроанализированы с помощью светового микроскопа Opton Axiovert-35 (CarlZeiss, Германия).
Оценка количества скрученных корневых волосков иколичества инфекционных нитей проводилась в 20 полях зрения для каждогокорня при увеличении в 300 раз. Наблюдаемое количество деформированныхи скрученных корневых волосков было выражено в значениях условногоМатериалы и методики186процента, который оценивался по шкале, состоящей из 21-го балла (взначениях кратных 5 от 0 до 100). Сравнение распределений по количествудеформированных,скрученныхкорневыхволосков,атакжечислуинфекционных нитей, наблюдаемых у растений различных линий, проводилис помощью критерия χ2.2.4.7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
