Диссертация (1144724), страница 30
Текст из файла (страница 30)
1987) и VF39 dctA–lacZ(Ronson et al., 1987) были любезно предоставлены Х. Санхуаном(Экспериментальная станция Дель Заидин, Гранада, Испания).б) штаммы VF39 fnrN–gusA (T. Patschkowski, неопубликованныерезультаты), VF39 nifA–gusA (Patschkowski et al., 1996) и fixNc–gusA (Schlüteret al., 1997) были любезно предоставлены У.Б.
Приефер.В опытах по анализу организации тубулиновых микротрубочек,проявлениязащитныхреакций,локализациипероксидаводорода,арабиногалактанпротеин-экстензинов в симбиотических клубеньках гороха, атакже анализу ультраструктурной организации клубеньков, растения былиинокулированы штаммом R. leguminosarum bv.
viceae 3841 (Wang et al., 1982).Материалы и методикиДляанализа174организациитубулиновыхмикротрубочеквсимбиотических клубеньках M. truncatula семена были инокулированыSinorhizobiummelilotiштамм490,сконститутивнымсинтезомфлуоресцентного белка mCherry (производный плазмиды pHC60 (tetR)(Cheng, Walker, 1998), в которой последовательность, кодирующая GFPзамещена последовательностью, кодирующей mCherry (J.
Fournier, LIPM,Тулуза, Франция, неопубликованные результаты).Для приготовления инокулюма бактерии выращивались на твердой TYсреде (Beringer, 1974) при температуре 28 °C с добавлением необходимыхантибиотиков: стрептомицина (Sm) 600–800 мкг/л; гентамицина (Gm) 40мкг/л; канамицина (Km) 200 мкг/л; тетрациклина (Tc) 10 мкг/л. Инокуляциюпроводили водной суспензией бактерий при разведении 107–108 клеток на 1растение.2.2. Условия выращивания и сбор материала для анализаДлягенетическихэкспериментовиразмножениярастениявыращивались в условиях, описанных ранее (Борисов et al., 1994). Дляпроведенияостальныхэкспериментоврастениявыращивалисьвклиматических камерах: HPS2000 (Heraeus Vötch, Германия), VB1514 (Vötch,Германия) в режиме день/ночь 16/8 ч, 21 °C, относительной влажности 75%,освещенности 490 мкМ фотонов м−2 с−1, MLR-352H (Sanyo Electric Co., Ltd.,Япония) в режиме день/ночь 16/8 ч, 21 °C, относительной влажности 75%,освещенности280мкМфотоновм−2 с−1.Семенастерилизовалиськонцентрированной серной кислотой в течение 10-30 мин (в зависимости отгенотипа) и промывались стерильной водой.Растения выращивались в стерильном вермикулите, кварцевом пескеили гидропонном растворе в сосудах различного объема в зависимости отэксперимента.
Использовались безазотные питательные растворы (Fåhraeus,1957; Borisov et al., 1997).Материалы и методикиДляоценкивлияния175хлоридакадмиянафункционированиесимбиотических клубеньков мутанта SGECdt и линии дикого типа SGEрастения были выращены в условиях жидкой гидропонной культуры.Стерилизованные семена располагали на плотиках из полистирола, которыеплавали в сосуде с гидропонной культурой, таким образом, чтобы главныйкорень проходил через отверстие в плотике, и вся корневая системапостоянно находилась в контакте с гидропоникой, а семядоля и наземнаячасть оставались на поверхности. Смену раствора гидропоник проводиликаждые 3-4 дня путем слива старого раствора через штуцер, соединенный свентилем, у основания сосуда и залива свежего раствора.
Гидропоннаякультура имела следующий состав: KH2PO4 — 110 мМ; Ca(NO3)2 — 50 мМ;MgSO4 — 400 мМ; KCl — 300 мМ; CaCl2 — 70 мМ; H3BO3 — 1 мМ; MnSO4— 1 мМ; ZnSO4 — 1 мМ; Na2MoO4 — 0,03 мМ; Fe2+ — 2,5 мМ. Гидропоннуюкультуруподвергалипостоянномуперемешиванию(аэрированию)спомощью компрессора и пористой насадки-распылителя газов. На 24-й деньпосле инокуляции растения подвергли воздействию 100 мкМ и 1000 мкМCdCl2 в течение 24 ч. После этого материал был зафиксирован сиспользованиемметодикипробоподготовкиматериаладлярутиннойэлектронной микроскопии (см. раздел 2.4.2.1).Для оценки влияние хлорида кадмия на развитие симбиотическихклубеньков гороха растения гороха мутанта SGECdt и линии дикого типаSGE выращивались при постоянной повышенной концентрации CdCl2 вгидропонной среде (в пределах от 0,5 до 2 мкМ CdCl2) в течение 4 недель.После этого материал был зафиксирован с использованием методикипробоподготовки материала для рутинной электронной микроскопии (см.раздел 2.4.2.1).При исследовании влияния экзогенных нитратов на формированиеклубеньков у гороха и L.
japonicus нитратный стресс создавали добавлениемв среду KNO3 до концентрации 5 мМ. В контроле ионную силуМатериалы и методики176поддерживали добавлением в среду KCl до концентрации 5 мМ. Также дляобеспеченияростарастенийвконтрольныйвариантдобавляласьминимальная доза азота в виде 0,5 мМ KNO3. Постоянство ионного составасубстрата поддерживали внесением 100 мл среды один раз в неделю. Двараза в неделю для полива использовалась стерильная дистиллированная вода.2.3.
Методика получения мутантов и генетический анализ2.3.1. Методика проведения мутагенеза и отбора мутантовВ качестве мутагена был использован этилметансульфонат. Методикапроведения мутагенной обработки была описана нами ранее (Борисов et al.,1994).Для проведения скрининга мутантов семена поколения M2 быливысажены в сосуды с кварцевым песком (8 кг/сосуд) с минеральнымпитанием без азота (Борисов et al., 1994). Поиск мутантов с нарушениями вразвитии азотфиксирующих клубеньков проводился на стадии 4-х недельныхрастений по признакам азотного голодания (остановка растений в росте,пожелтение нижних листьев) и при визуальном осмотре корневых системрастений. Отобранные потенциальные мутанты были высажены обратно всубстрат с минеральным питательным раствором, содержащим азот (Борисовet al., 1994) для получения семян М3.
Также были посажены все родственныерастения из семьи, где наблюдалось растение с потенциальной мутацией дляполучения от них семян М3. В дальнейшем эти семена были использованы вкачестве материала для повторного поиска мутаций в случаях, если неудавалась получить семена с потенциального мутанта, отобранного прискрининге растений М2.2.3.2. Гибридологический анализСкрещивания между линиями гороха проводили на стадии бутонизации—началацветения.Материнскиецветки(всостояниибутонов)Материалы и методики177препарировали с помощью пинцета и удаляли из них незрелые тычинки.Пыльцу отцовских цветков с помощью пинцета наносили на рыльце пестика.Чистоту опыления, когда это было возможно, контролировали по признакам,которыми различались родительские линии.Фенотипический анализ проводили как для растений поколения F1,полученных путем гибридизации, так и для растений поколения F2,полученных путем самоопыления растений F1.Соответствие реальных расщеплений в поколении F2 с теоретическимрассчитывали с помощью критерия χ2.2.3.3.
Комплементационный анализПри проведении комплементационного анализа Nod− и Fix− мутантов вкачестве тестерных линий были использованы Nod− и Fix− мутанты изколлекцииФБГНУ(http://www.arriam.spb.ru/rus/lab9/collections.html),ВНИИСХМпредставляющиевсеидентифицированные к настоящему времени гены, контролирующие ранниеи поздние стадии развития клубеньков, соответственно (Таблица 1) (см.раздел 2.1.).
Для проведения тестов на аллелизм каждый выявленный мутант,вовлеченный в комплементационный анализ, был реципрокно скрещен совсеми тестерными линиями. Результаты тестов на аллелизм получали прианализе растений поколения F1.2.3.4. Анализ совместного наследованияАнализ совместного наследования локуса интереса, морфологических(Хангильдин, 1990) и молекулярных маркеров (Таблица 3, Таблица 4,Таблица 5, Таблица 6) был проведен с использованием компьютернойпрограммы PLANT (С.М. Розов, Институт цитологии и генетики СО РАН).Построение генетических карт районов локализации локусов интересаМатериалы и методики178проводили с помощью программы AntMap (Iwata, Ninomiya, 2006) илипрограммы JOINMAP (Stam, 1993).2.4.
Методики пробоподготовки и микроскопии2.4.1. Методикапробоподготовкидлясветовойилазернойсканирующей конфокальной микроскопии2.4.1.1. Методика фиксации материала для световой и лазернойсканирующей конфокальной микроскопииНами была использована модифицированная методика фиксациикорней кукурузы (Baluška et al., 1992), после которой срезы заключали в воскСтидмана (Vitha et al., 1997), и предложена новая методика фиксацииазотфиксирующих клубеньков (Kitaeva et al., 2016). Клубеньки горохаинкубировали в фиксирующем растворе (3% формальдегида, 0,25%глутаральдегида, 0,3% Tween-20, 0,3% Triton X-100 в 1/3 концентрациибуфера MTSB (50 мМ пиперазин-N,N’-бис(2-этансульфоновая кислота),5 мM MgSO4 и 5 мM этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’тетрауксусная кислота, pH 6,9) 7 мин под вакуумом и 15 мин без вакуума,процедуру повторяли 6-7 раз.
После этого клубеньки оставляли на ночь при4 °C.2.4.1.2. Методика заключения материала для световой и лазернойсканирующей конфокальной микроскопииПосле фиксации клубеньки промывали в 1/3 концентрации MTSB трираза по 20 мин. Далее клубеньки заключали в воск Стидмана помодифицированной методике (Stumpe et al., 2006). Для дегидратированияматериал проводили через серию различных концентраций этанола (10, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96%), в течение 10, 20, 30 и 40 мин для первыхчетырех концентраций, соответственно, и 50 мин для последующихконцентраций. Затем клубеньки были окрашены 0,1% толуидинового синегоМатериалы и методики179в этаноле в течение ночи. После двукратной отмывки в течение 1 ч 96%этанолом клубеньки заключали в смеси воска Стидмана и этанолавозрастающих концентраций (10, 20, 35, 50, 80%) при 40 °С, времяинкубации на каждом этапе составило 2 ч.
Далее материал был погружен наночь в 100% воск Стидмана при 40 °С. После этого материал был переведен вновый 100% воск Стидмана, после 2 ч инкубации, клубеньки былиразложены в формы, залиты 100% воском Стидмана, после чего блоки склубеньками держали при 4 °C в течение 30 мин.2.4.1.3. Методика приготовления срезов без заключения материаладля световой и лазерной сканирующей конфокальной микроскопииВместо заключения клубеньков в воск Стидмана использовали толстые(50 мкм) срезы без заливки в среду. Для этого клубеньки после фиксациипромывали в 1/3 концентрации MTSB и заключали в блоки 3% агарозы.Срезы получали с использованием микротома с вибрирующим лезвиемHM650V (Microm, Германия), после чего их промывали в 1/3 концентрацииMTSB.
Данная методика позволила избежать использования длительныхпроводок в этаноле и этапов заключения в воск Стидмана.2.4.2. Методика пробоподготовки для электронной микроскопии2.4.2.1. Методикапробоподготовкиматериаладлярутиннойэлектронной микроскопииКлубеньки после сбора были перенесены непосредственно в 2,5%водный раствор (v/v) глутаральдегида (Sigma-Aldrich, США) на 0,01 Мфосфатном буфере (рН 7,2).
После 16 ч фиксации при температуре 4 °Склубеньки были проведены по серии спиртов возрастающей концентрации(по 20 мин в 30, 50, 70, 90 и 100% этаноле при комнатной температуре), затемпомещались на 10 мин в смесь из 100% этанола и ацетона в соотношении1 : 1, после этого выдерживались дважды по 20 мин в чистом ацетоне. ДалееМатериалы и методики180материал пропитывался по 1 ч в трех смесях эпоксидной смолы EMbed-812(Honeywell Fluka, Thermo Fisher Scientific Inc., США) и ацетона (всоотношении 1 : 1, 2 : 1 и 3 : 1 соответственно), затем в свежеприготовленнойсмеси чистой смолы в течение ночи при комнатной температуре.Полимеризация проводилась в термостате INB 400 (Memert, Германия) при60 °С в течение 48 ч.2.4.2.2.
Методикапробоподготовкиматериаласнизкотемпературной заливкой для электронной микроскопииКлубеньки после сбора переносили в 2,5%-ный водный растворглутаральдегида (Sigma-Aldrich, США) на 0,5 М какодилатном буфере (рН7,2) с последующим вакуумированием и сменой фиксатора. Через 16 чфиксации при комнатной температуре клубеньки обезвоживали в серииспиртов возрастающей концентрации (30% — на льду в течение 1 ч, 50% —при −20 °С в течение 1 ч, 70, 95% и 100% при −35 °С по 1 ч), пропитывали всмеси спирта и акриловой смолы London Resin White (Sigma-Aldrich, США) всоотношении 1 : 1, 1 : 2 и 1 : 3 по 1 ч, затем в чистой смоле в течение 1 ч идвух сменах чистой смолы по 8 ч. Далее образцы переносили впредварительнозаполненныехолоднойсмолойсиспользованиембензоинметилэфира в качестве катализатора BEEM-капсулы при −20 °С ипомещали в отделение для УФ-полимеризации при −20 °С в течение 24 ч ипри комнатной температуре в течение 16 ч в Tissue-Tek Vacuum InfiltrationProcessor (Sakura Finetek, Великобритания).2.4.3 Методика иммунолокализации2.4.3.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
