Диссертация (1144724), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Используемые праймерыДля локализации локусов Pssym31 (Таблица 3) и Pssym33 (Таблица 4)были использованы праймеры, позволяющие проводить аллель-специфинуюМатериалы и методики193ПЦР. Для локализации локуса Pscdt были использованы праймеры,позволяющие проводить аллель-специфичную ПЦР (Таблица 5), а такжепраймеры, позволяющие получатьмаркеры, основанные на аллель-специфичной рестрикции продуктов ПЦР (Таблица 6).
Для проведения ПЦРв реальном времени уровня транскриптов генов, активирущихся в ходезащитных реакций, были использованы последовательности 3-х генов(Таблица 7), а генов, ассоциированных со старением, были использованыпоследовательности 7-ми генов (Таблица 8).
При создании генетическихконструкций nifH-PsMT1 и nifH-PsMТ2 были использованы праймеры длягенов, кодирующих металлотионеины гороха, а также нитрогеназу R.leguminosarum (Таблица 9).Таблица 3. Маркеры, основанные на аллель-специфичной ПЦР, использованные для локализациилокуса Pssym31Продукт, кодируемыйПраймеры (прямой и обратный) Температура соответствующим геномИсточникМаркер5’-3’отжига, °Спо:последовательностиhttp://www.ncbi.nlm.nih.govEST638430 MTUSCCCATATGTCCACCACCTTCMedicago truncatula cDNA61mtmt_GEN_00097_03_1CA920712ATCCACATGCTGATTTTCCCclone MTUS-31E4, mRNAsequencePisum sativum cultivarCAAGAAAGATGGGAAGGAGTerese dioxygenase57Max4(Rms1)AY557341TGTCCATCCTCAAAGTGAAGRAMOSUS1 (RMS1) gene,complete cdsAAGTGAAAGGGCAGGGAACTPisum sativum cDNA clonepsmt_EST_00197_01_160CD861247GCAGTGTCCTCGTCATCAGAWP009C09Pisum sativum SN4TDRTGTGATTATCACTTTCTTTC54SN4TDRmRNA for 110 kDaAB078603CACCTCCCAAGACATCTGTA4SNc-Tudor domain proteinAGGAAATACAAATTCTTCTGAPisum sativum mRNA forcalnexin54Y17329TACAATAATCTTCTCCTTTTGcalnexinACTTCTTTGTGCCCATGATGPisum sativum JI15polyaden60EU271219AGACCTGTTGCTGCATCATTpolyA-binding protein geneG-proteinGGTGGATTTACTGGCAGCAGAGTTCATTACCACGGGCAT60Pisum sativum pectinmethylesterase (rcpme1)gene, complete cdsAF081457Материалы и методики195Таблица 4.
Маркеры, основанные на аллель-специфичной ПЦР, использованные для локализациилокуса Pssym33МаркерПраймеры (прямой и обратный)5’-3’Температураотжига, °СПродукт, кодируемыйсоответствующим геном по:http://www.ncbi.nlm.nih.govИсточникпоследовательностиe40TGAAGGTTGTCTGGTGTCTATTGAAGAAAAGAAACAGGAATTA55P. sativum mRNA foe eraly noduline40X81064sym19TTCCAGGCCTAAAGTCAAACTCACTTTGCCGTTGAGTTC59Pisum sativum SYM19 mRNA,complete cdsAF491997Материалы и методики196Праймеры (прямой и обратный)5’-3’Температураотжига, °СмаркерТаблица 5. Маркеры, основанные на аллель-специфичной ПЦР, использованные для локализациилокуса PsCdtПродукт, кодируемыйсоответствующим геномПродукт,кодируемыйПЦР,соответствуюспецифичнаящим геномдля линиипо:http://www.ncbi.nlm.nih.govGTGGTGGCCTATGTCCTCC57SGECdtAACTGCATCACCACCCATTCTAPisum sativum knotted1-likeAF080104Pskn16class I homeodomain proteinGTGGTGGCCTATGTCCTCC68JI 281AACTGCATCACCACCCATTCTCCCGCAACTTCTGCGAGGAAC65SGECdtPisum sativum mRNA forTGTTCTTCTACGCCTGAATTTCputative His-AspAJ831475HptBCCGCAACTTCTGCGAGGAACphosphotransfer protein65JI 281TGTTCTTCTACGCCTGAATTTTGCCTGCATTCCGAAACCAACGPisum sativum mRNA forSUS3**62AJ311496JI 281GATGCGTTTGAGCATCTCCTCsucrose synthase isoform 3AATGGCCAGACATATATACGATG65SGECdtCAACMGGTGTGGAKAGGATAAGAHeavy metal ATPase 3*HMA3AATGGCCAGACATATATACGATT66JI 281CAACMGGTGTGGAKAGGATAAGAСимволом * отмечены гены, последовательности которых не известны для гороха посевного, символом ** —последовательность гена, для которого были использованы праймеры, описанные в литературе (Aubert et al., 2006).Материалы и методики197МаркерПраймеры (прямой и обратный)5’-3’Температураотжига, °СРестриктазаТаблица 6.
Маркеры, основанные на аллель-специфичной рестрикции продуктов ПЦРS27ETTGTTAAACCCACCAGCTGAGCGCACACCACAACAGTTTGAG58MnlIIFTCCTCCGCCACTTCCAAACCTCCATTTCCCACCATTAGCACA58HhaI58HpaII58AluIP450GHAACACAARAATCTCCGCCGTCACCGCTYGCGTGTACTTCATCTTYACRGATCGGTCAGGACAGACCGCTYGCGTGTACTTCATCAAACTGCRGACACKGTAAACACTGTGGTCAGGAGCMAGTTGAAGCA58Csp6IPTACGGAAYTGGAGAAAGCCGGAGATCAYGGTTGGRTAAACTGGATC59SalIPTPTCCGTTGGACAKCCCAACAAC56TspEIПродукт,кодируемыйсоответствущимгеномRibosomal proteinS27EPisum sativumeukaryotictranslationinitiation factor 4ECytochrome P450GlycosidehydrolaseArabidopsisthaliana AAA-typeATPase familyproteinArabidopsisthaliana plastidtranscriptionallyactive 12PentatricoПродукт,кодируемыйсоответствующим геномпо:http://www.ncbi.nlm.nih.govРестриктаза,специфичнаядля линии*JI 281DQ641471JI281*SGECdt*SGECdt*JI281*SGECdt*JI281Материалы и методики198TTCCACYCTCCCTTTCTCACApeptide repeatExosome complexCTGATCCCTCCTTTGAGCCTG60MboIIEXexonuclease*GACSGCAAYTGGAAGATGATGTRRP45Символом * отмечены гены, последовательности которых не известны для гороха посевного.JI281Материалы и методики199Таблица 7.
Последовательности праймеров для проведения ПЦР в реальном времени для анализауровня транскриптов генов защитных реакцийИсточникпоследовательностиПродукт, кодируемыйсоответствущим геномПраймеры (прямой и обратный) 5’-3’Размерампликона(п.о.)AF396465Peroxidase 7RA84TGTTTGAATCAGATGCTGCATTG75CATTTGATTGAAGATGTTGTGCAAaTC107779Hypersensitive reaction203JTGTTTGAATCAGATGCTGCATTGCATTTGATTGAAGATGTTGTGCAA70Z15128.1ABA-responsive proteinTGGGTGTCTTTGTTTTTGATGATGA440TATGGCCTTGATAAGTCCAGTTCCT— Идентификационный номер в TIGR M.
truncatula Gene IndexБыли использованные праймеры, описанные ранее в литературе (Martin et al., 1993; Iturriaga et al., 1994; Pérezde-Luque et al., 2006; Die et al., 2007; Die et al., 2009).aТаблица 8. Последовательности праймеров для проведения ПЦР в реальном времени для анализауровня транскриптов генов, ассоциированных со старениемИсточникпоследовательностиПродукт, кодируемыйсоответствущим геномПраймеры (прямой и обратный) 5’-3’Размерампликона(п.о.)U44947.1Cysteine protease 1(PsCyp1)CCACCTTTCTCTCCTTAATTAGCC123X54358.1X66061.1CCTTGTTACTACGTCCACTTGACACysteine protease 15a(PsCyp15a)GTAGCTGCAGCTCAATCCAACCCATCACCACAGTAACAGCAAGACAThiol protease (PsTPP)TGAATCCCCCTAAGCCTGCT222280GCCGGAGTTCGTTTGAATGAC* 69046EF491600.1AF016459.1M98357.1Transcription factor bZIP(PsATB2)GAGACGGTCTCGGATGAGGAAATCAGAGGGTTGAAGAAGAAGAAGCAldehyde oxidase 3(PsAO3)TTATAGGACACAGGCTAGCTCAGCA1-aminocyclopropane-1carboxylate synthase 2(PsACS2)GGCATAGTAATTTGAGGTTGAGCC1-aminocyclopropane-1carboxylate oxidase 1(PsACO1)272127TGACACAAGCTTATTCAGCATGACA226GCCCCAACATTTAAAGGACCTATTATACATGGGACTCAAGTTCCAAGCTGCACAATCTTAAAACACCAACCAAA* последовательность контига для гороха в базе https://www.coolseasonfoodlegume.org/159Материалы и методики201Праймеры были подобраны на основе данных транскриптомного анализа M.
truncatula (Van de Velde et al., 2006) идругих исследованиях (Granell et al., 1992; Kardailsky, Brewin, 1996; Peck, Kende, 1998; Martin et al., 1999; Pariasca etal., 2001; Zdunek-Zastocka, 2008; D’haeseleer et al., 2010).Таблица 9. Последовательности праймеров, использованные при создании генетических конструкцийnifH-PsMT1 и nifH-PsMТ2ИсточникпоследовательностиПродукт, кодируемыйсоответствущим геномПраймеры (прямой и обратный) 5’-3’Размерампликона(п.о.)AB176564.1Pisum sativum MEY mRNA fortype 1 metallothioneinATGTCTGGATGTGGTTGTGGA (MT1-FOR)268Pisum sativum MET mRNA fortype 2 metallothioneinTGTCTTGCTGTGGTGGAAACT (MT2-FOR)Rhizobium leguminosarum bv.viciae plasmid pRL10 completegenome, strain 3841GGATCCCGTCGTTGCCTGCTG (nifH-FOR)AB176565.1AM236084.1GCCTCCAATATCTCTGCTTCA (MT1-REV)264ATCCTGCCACTAAACGGGG (MT2-REV)GTTTGGCGTTCCTTCATGTGTTC (nifH-REV)7502.5.10. Анализ генной библиотекиБиблиотека кДНК гороха (сорт Finale), «обогащенная кДНК корневыхволосков» (вектор лямбда ZapII), была любезно предоставлена ХенкомФранссеном(СельскохозяйственныйуниверситетВагенингена,Нидерланды).
Информация о последовательности ДНК участка (около 2000п.о.) генома гороха, содержащего ген гороха, гомологичный гену Nin L.japonicus и праймеры для ПЦР амплификации различных сегментов данногоучатстка были любезно предоставлены Йенсом Стоугаардом (Орхускийуниверситет, Дания).На основе данного сегмента был создан зонд для скрининга геннойбиблиотеки с целью идентификации фрагментов, содержащих участки кДНКгена, гомологичного гену Nin L.
japonicus. Библиотека была исследована(около 1,5 миллиона клонов) в соответствии с протоколом фирмыSTRATAGENE для скрининга пользовательских библиотек на основе фагалямбда.2.5.11. ПЦР с детекцией в реальном времени2.5.11.1. Выделение тотальной РНКДля выделения тотальной РНК клубеньки исследуемых генотиповбыли заморожены в жидком азоте. Навеска одной пробы растительногоматериала составляла 60–100 мг. Срезанные клубеньки гомогенизировались встерильных фарфоровых ступках. Выделение тотальной РНК проводилось спомощьюреагентаPureZol(Bio-Rad,США)согласнопротоколупроизводителя.
Концентрация и качество тотальной РНК было определено спомощью системы электрофореза на микрочипах длянуклеиновых кислот MultiNA (Shimadzu Corporation, Япония).исследованияМатериалы и методики2032.5.11.2. Синтез кДНКДля синтеза кДНК было взято 1,5 мкг тотальной РНК, обработаннойDNAse I (MBI Fermentas, Латвия). Реакционная смесь для обратнойтранскрипции содержала: 0,5 мкг Oligo(dT)18, 200 ед.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
