Диссертация (1144724), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Таким образом, было показано, что мутантыSGENod−–1 и SGENod−–3 несут мутации в гене Pssym35, мутант SGENod−–2— в гене Pssym14, мутант SGENod−–6 — в гене Pssym7, мутанты SGENod−–4и SGENod−–8 — в гене Pssym38.В ходе комплементационного анализа Fix− мутантов, в который быливключены 11 тестерных мутантных линий, было показано, что мутантныйфенотип линии SGEFix−–5 определяется мутацией в локусе Pssym33, линииSGEFix−–6 — мутацией в локусе Pssym40, линии SGEFix−–7 — мутацией влокусе Pssym27, линии SGEFix−–8 — мутацией в локусе Pssym25.Также был проведен комплементационный анализ мутантной линииRisFixV, индуцированной на сорте Finale, в результате чего было показано,что данная линия несет мутацию в ранее не идентифицированном локусе,получившем обозначение Pssym42.Таблица 11.
Анализ расщепления по фенотипу растений поколенийF1 и F2 от скрещиваний исходной линии SGE и Nod− мутантов горохаСкрещиваниеF2F1χ2(3:1)(♀ х ♂)Nod : NodSGE-330 x SGE5 : 060 : 210,04SGE x SGE-3303 : 041 : 130,02+−+Nod : Nod−Таблица 12. Анализ расщепления по фенотипу растений поколенийF1 и F2 от скрещиваний исходной линии SGE и Fix− мутантов горохаСкрещиваниеF1(♀ х ♂)Fix : FixSGE x SGE-1033 : 0+F2−+Fix : Fix25 : 7−χ2(3:1)0,17Результаты и обсуждение221SGE-103 x SGE4 : 054 : 170,04SGE-249x SGE9 : 0103 : 37 0.15SGE x SGE-2495 : 036 : 160.92SGE-268 x SGE5 : 035 : 100.19SGE x SGE-2684 : 025 : 60.53SGE-403 x SGE7 : 045 : 160.05SGE x SGE–4033 : 026 : 100.15Таблица 13. Анализ расщепления по фенотипу растений поколенийF1 и F2 от скрещиваний исходной линии SGE и SGEFix−-9 мутанта горохаСкрещиваниеF1(♀ х ♂)Fix : FixSGEFix−-9 x SGE6 : 0Представленная+F2−+−Fix : Fix : Nodпрограмма+/−: Nod+/−−Fixχ2(9:3:3:1)90 : 39 : 24: 177,694химическогоЭМС-мутагенезалабораторной линии гороха SGE направлена на получение новых мутантовпо симбиотическим признакам.
Ранее линия SGE уже была успешноиспользована для получения такого рода мутантов (Tsyganov et al., 1994).Методнегативнойселекции,врезультатекоторогопотенциальныесимбиотические мутанты отбираются по признакам азотного голодания, атакже извлечение растений из субстрата для визуального осмотра ихкорневых систем, приводят к снижению жизнеспособности отобранныхмутантов и снижению вероятности получения от них семян поколения М3.Высокая урожайность линии SGE (Kosterin, Rozov, 1993) позволяетуменьшать негативные последствия используемой системы скрининга.Действительно, семена М3 были получены нами от 71,7% отобранныхпотенциальных мутантов. Следует отметить, что в данном исследованииРезультаты и обсуждениенаблюдаласьоченьсимбиотическихвысокаямутантов222частота—2,17%возникновения(45потенциальныхмутантовна2069проанализированных растений М2).
Эта частота превышает величины,описанные в ходе проведения других программ по мутагенезу гороха(Jacobsen, 1984; Engvild, 1987; Kneen, LaRue, 1988; Duc, Messager, 1989;Tsyganov et al., 1994; Борисов et al., 1994). В то же время, следует отметить,что не все потенциальные мутанты подтвердили стабильность проявлениямутантного фенотипа в ряду поколений, что может объясняться, преждевсего, сложностью проявления симбиотических признаков, зависящих отвзаимодействия генотипов макро- и микросимбионтов, а также сильноговлияния окружающей среды на проявление данных признаков. Аналогичнаякартина наблюдалась и при анализе большой коллекции мутантов,индуцированных на основе сорта Finale (Engvild, 1987), при детальноманализе которой не для всех мутантов были подтверждены мутантныефенотипы (Novák, 2003).В данном исследовании были выявлены мутанты по всем основнымфенотипическим классам, известным для симбиотических мутантов: Nod−,Nod+/−, Fix−.
Не были получены только мутанты, формирующие повышенное,по сравнению с исходной линией, количество клубеньков, так называемыесуперклубенькообразующие мутантны (Nod++) (Таблица 1). Nod− и Nod+/−мутанты, отобранные в ходе данной работы, а также ранее полученные,представляли большой интерес для выявления основных симбиотическихлокусов, контролирующих инфекцию и органогенез клубенька. Fix− мутантыявлялись удобными моделями для изучения процесса дифференцировкиклеток клубенька.Гибридологический анализ линии SGE-192 показал, что данный мутантнесет мутации в двух несцепленных симбиотических генах, один из которыхопределяет образование уменьшенного количества клубеньков (Nod+/−фенотип), а другой — формирование неэффективных клубеньков (Fix−фенотип). Ранее в литературе были описаны случаи возникновения в геномеРезультаты и обсуждение223после экспериментального ЭМС-мутагенеза мутаций в двух различныхсимбиотических генах. Так, гибридологический анализ мутанта гороха E135F(Pssym13), характеризующегося Fix− фенотипом, показал, что растенияданной линии несут в гетерозиготе рецессивную мутацию в другом гене —Pssym14, определяющую Nod− фенотип (Kneen et al., 1990).
Послеэкспериментального ЭМС-мутагенеза растений L. japonicus была полученалиния LjEMS40, которая несла мутации в двух несцепленных генах: Ljsym22и Ljsym34. Мутация в гене Ljsym22, определяет Nod− фенотип, а мутация вгене Ljsym34 — формирование клубеньков, количество которых в несколькораз превышает число клубеньков у растений дикого типа (Nod++ фенотип)(Szczyglowski et al., 1998). Таким образом, методом индуцированного ЭМСмутагенеза могут быть получены в одном геноме мутации в нескольких несцепленных симбиотических генах, контролирующих различные стадиисимбиотических взаимоотношений.Большая часть Fix− мутантов, полученных в данном исследовании,была распределена по 4-м группам комплементации.
Ранее по гену Pssym33были описаны 2 мутации: у мутанта SGEFix−–2 (Tsyganov et al., 1998)индуцирована нами ранее c использованием линии SGE, а также у мутантаRisFixU получена на сорте Finale (Engvild, 1987; Borisov et al., 2004). Для генаPssym40 известна лишь одна уникальная мутация у мутанта SGEFix−–1(Tsyganov et al., 1998), полученная на основе линии SGE нами ранее. Для генаPssym27 известны 2 мутации: у мутанта P12 индуцирована на сорте Frisson(Duc, Messager, 1989; Borisov et al., 2004) и у мутанта RisFixQ получена наоснове сорта Finale (Engvild, 1987; Borisov et al., 2004). Ранее были описаны 4мутанта по гену Pssym25, все они были индуцированы на сорте Frisson (Duc,Messager, 1989; Borisov et al., 2004).Ранее полученные на линии SGE Nod− мутанты также рапределилисьпо 4 группам комплементации.
Ранее по гену Pssym7 были полученымутации E69, N12, индуцированные на сорте Sparkle (Kneen et al., 1994),RisNod14 — на сорте Finale (Engvild, 1987; Borisov et al., 2004). Для генаРезультаты и обсуждение224Pssym14 была получена лишь 1 мутация E135n, индуцированная на сортеSparkle (Kneen et al., 1990). Для генов Pssym35 и Pssym38 также былиизвестны лишь одиничные мутации RisNod8 и RisFixF, соответственно,индуцированные на сорте Finale (Engvild, 1987; Borisov et al., 2004).Таким образом, нами были выявлены новые мутации в раннихсимбиотических генах Pssym7, Pssym14, Pssym35 и Pssym38 и позднихсимбиотических генах Pssym25, Pssym27, Pssym33 и Pssym40.
Данныемутации представляют большой интерес для решения вопроса о возможнойгенотипическойспецифичностимутагенеза.Кнастоящемувременипрограммы по мутагенезу гороха были проведены с использованием 7генотипов (Borisov et al., 2004). При анализе распределения полученных с ихиспользованием мутаций по группам комплементации становится ясным, чточасть групп комплементации представлена единичными, уникальнымимутациями, выявленными лишь у одного генотипа. Также были выявленыгруппыкомплементации,например,Pssym5,Pssym29,Pssym34,представленные сериями независимых мутаций, но индуцированных лишь наодном генотипе (Borisov et al., 2004). В эту же группу попадали и мутации погену Pssym25, однако, в ходе данной работы была выявлена мутация в этомжегене,индуцированнаяналинииSGE.Поэтомупредставляетсяцелесообразным проведение дальнейшего поиска новых симбиотическихмутацийсиспользованиемопределенныхгенотипов(наиболееперспективными являются SGE и Frisson, для которых проведениемутационных программ продолжается в настоящее время) и вовлечениеполученных новых мутантов в комплементационный анализ.
Это позволитполучить более представительные коллекции мутантов с использованиемодного конкретного генотипа, что, в свою очередь, даст возможностьответить на вопрос о возможной генотипической специфичности мутагенезав отношении симбиотических генов гороха.В ходе данной работы проанализированные мутанты были отнесены кранее описанным группам комплементации, при этом не было выявленоРезультаты и обсуждение225ранее не идентифицированных симбиотических генов гороха. Данный фактсвидетельствует, по-видимому, о близости решения задачи — выявленияполного круга симбиотических генов гороха, выявляемых методамиэкспериментального мутагенеза. Таких генов, на сегодняшний день,обнаружено чуть более 40 (Borisov et al., 2004).
В то же время следуетотметить,чтовкомплементационногоходедетальногоанализаиколлекцииблизкогоксимбиотическихзавершениюмутантов,индуцированных на сорте Finale (Engvild, 1987), проводимого в 3-хразличных лабораториях, было выявлено 9 ранее не идентифицированныхгенов гороха (Tsyganov et al., 2001; Novák, 2003; Borisov et al., 2004).Генетический анализ коллекции мутантов, описываемой в данной работе,также еще не завершен до конца, поэтому не исключено, что неописанныеранее симбиотические гены гороха еще будут обнаружены в ходедальнейших исследований.Важный вопрос, который возникает при анализе симбиотических генов— какой именно ген можно считать «симбиотическим».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
