Диссертация (1144724), страница 34
Текст из файла (страница 34)
акт. RevertAid ReverseTranscriptase, 1 мМ dNTP Set, 20 ед. акт. RiboLock RNase Inhibitor (MBIFermentas, Латвия) и вода, обработанная DEPC (Thermo Fisher Scientific,США). Реакция обратной транскрипции проводилась согласно протоколупроизводителя RevertAid Reverse Transcriptase (MBI Fermentas, Латвия) вавтоматическом амплификаторе С1000TM Thermal Cycler (Bio-Rad, США).Температурный режим реакции: 40 °С в течение 60 мин, 70 °С в течение10 мин. Хранение препаратов кДНК при −20 °С.2.5.11.3.
Относительный ПЦР-анализ в режиме реального времениОтносительный ПЦР-анализ в режиме реального времени проводили спомощью набора iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Геркулес, США). 10 мклреакционной смеси содержало: 5 мкл SYBR Green Supermix (Bio-Rad,Геркулес, США), 0,04 мкМ каждого праймера, 0,8 мкл кДНК (1:5).Реакция осуществлялась в автоматическом амплификаторе С1000TMThermal Cycler, совмещенном с оптическим модулем CFX96TM Real-TimeSystem Manager (Bio-Rad, США).
Температурный режим амплификациисоответствовал протоколу к набору iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad,США). Результаты были обработаны с использованием программы Bio-RadCFX Manager, предоставленной поставщиком прибора для проведения ПЦР вреальном времени. Расчет уровня экспрессии проводился методами 2ΔCT и2−ΔΔCTсиспользованиемреференсногоглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназупраймеров:гена(L07500.1,GapC1,кодирующегопоследовательности5’-AAGAACGACGAACTCACCG-3’,5’-TTGGCACCACCCTTCAAATG-3’).
Эксперименты были проведены в трехповторностях, 6–8 растений на вариант.Материалы и методики2042.5.12. SSAP анализSSAP анализ основан на однократной рестрикции геномной ДНК сиспользованием рестриктазы TaqI, с последующим лигированием адаптера клипким концам. ПЦР проводится с использованием радиактивно меченногопраймера к последовательности ретротранспозона и праймера к адаптеру сселективными основаниями, при этом в качестве матрицы служатрестрицированные и лигированные с адаптером фрагменты ДНК. ПродуктыПЦР далее разделяются с помощью электрофореза (Schulman et al., 2004).Ниже приведены последовательности использованных праймеров иадаптера. В качестве ретротранспозона был использован PDR1 элемент, наоснове PPT (polypurine tract) данного элемента был синтезирован PDR1-PPTпраймер.Taq адаптер:5’-ATGAGTCCTGAA-3’3’-TACTCAGGACTTGC-5’Праймер к Taq адаптеруATGAGTCCTGAACGAXXРадиактивномеченныйпраймерPDR1-PPTATTCACCAGCTTGAGGGGAGРестрикция геномной ДНК проводилась в объёме 40 мкл сиспользованием 0,5 мкг матрицы, 5 единиц рестриктазы TaqI (Invitrogen,США), 8 мкл 5-ти кратного буфера RL (10 мM TRIS-ацетата pH 7.5, 10 мMMg(CH3COO)2, 50 мM KCH3COO, 5 мM 1,4-дитиоэритритола, 5 нг/мклбычьегосывороточногоальбумина(BSA).Реакционнаясмесьинкубировалась при 65 °С 3 ч.Для лигирования с адаптером к 40 мкл рестрикционной смесидобавляли 12,5 пмоль Taq адаптера, 1 мМ АТФ и 1 единицу Т4 ДНК лигазы(Invitrogen, США), 2 мкл 5-ти кратного буфера RL, доводя объём до 50 мкл.Материалы и методики205Реакционная смесь инкубировалась при 37 °С в течение ночи.
Полученная врезультате лигирования SSAP матрица растворялась в 100 мкл 0,1 буфера ТЕ(pH 8,0) и хранилась при температуре −20 °С. Для проведения ПЦРиспользовалось 3 мкл данной смеси.Длясозданиямеченогопраймераиспользовалисьследующиекомпоненты: PDR1-PPT праймер, концентрацией 100 нг/мкл, [γ-33P]ATФ(концентрацией370 кБк/мкл),10-тикратныйбуфердляполинуклеотидкиназы Т4, вода, 5 единиц полинуклеотидкиназы Т4. Смесьинкубировали при 37 °С 1 ч.ПЦРсмеченымпраймеромпроводиласьсиспользованиемамплификатора PTC-200 Thermo Cycler (MJ Research, США). Реакционнаясмесь на 30 реакций содержала 20 мкл меченого33P праймера PDR1-PPT,15 нг немеченого праймера с селективными основаниями (концентрацией7,5 нг/мкл), 200 мкМ каждого из дезоксирибонуклеотидов, 6 единиц Taqполимеразы(Invitrogen, США), 30 мкл 10-тикратного буфера дляполимеразы и 3 мкл полученной ранее SSAP матрицы.
Объем реакционнойсмеси составлял 10 мкл. Условия проведения ПЦР: 12 циклов амплификации:денатурация (94 °С — 30 сек), отжиг праймеров 65 °С (с уменьшениемтемпературы на 0,7 °С за цикл до 56 °С) — 30 сек), синтез ДНК (72 °С —60 сек); 24 цикла амплификации: денатурация (94 °С — 30 сек), отжигпраймеров 56 °С — 30 сек), синтез ДНК (72 °С — 60 сек) окончание синтезаДНК (72 °С — 7 мин) (Vos et al., 1995). После окончания синтеза креакционной смеси было добавлено 10 мкл стоп-раствора (94% (раствор(v/v)) формамида, 10мM ЭДТА pH 8.0, 0,5 мг/мл ксилена цианола, 0,5 мг/млбромфенола голубого), смесь прогревали при 95 °С 3 мин и затем охлаждалипри 12 °С. Реакционную смесь хранили при температуре −20 °С.Фрагменты разделяли в 6% денатурирующем акриламидном гелесогласно (Sambrook et al., 1989) в течение 2 ч при напряжении 1500 В.Материалы и методики206Высушенный гель на 3ММ бумаге анализировали с помощью системы длявизуализацииTyphoon9200ScannerGE(HealthcareLifeSciences,Великобритания) и проявляли с использованием рентгеновских пленок (Fuji,Япония).2.5.13.
Лазерная микродиссекция2.5.13.1. Подготовка образцовПри подготовке образцов для лазерной микродиссекции былаиспользована модифицированная методика (Kuznetsova et al., 2010). Дляфиксации клубеньков гороха использовался свежеприготовленный фиксаторметакарн (60% метанол, 30% хлороформ, 10% ледяная уксусная кислота).Инфильтрация фиксатора проводилась под вакуумом (-0.9 атм) в течение5 мин трижды с 15 мин интервалом. Далее образцы инкубировались вфиксаторе в течение ночи при 4 °C. После удаления фиксатора клубенькибыли дегидрированы посредством серии растворов этанола: 70, 75, 85, 90,96% (3x) в течение 15 мин при комнатной температуре.
Далее образцыинкубировались в серии растворов этанол (96%)/хлороформ (v/v) (3 : 1, 1 : 1и 1 : 3) и чистый хлороформ в течение часа при комнатной температуре споследующим заключением в парафин Paraplast plus (Electron MicroscopySciences, США) при 60 °С в течение ночи. Залитые в блоки образцыхранились при 4 °С.Срезы толщиной 10 мкм были получены с помощью микротома HM360(Microm, Германия). Парафиновые ленты со срезами были помещены настекла, покрытые PET — мембраной (Carl Zeiss, Германия), с добавлениемнескольких капель DEPC — воды (Thermo Fisher Scientific, США).Предварительно стекла были покрыты 10%-ным раствором овальбумина вDEPC — воде (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением RiboLockRNase Inhibitor (20 ед.
акт.; MBI Fermentas, Литва). Высушенные в течениеночиприкомнатнойтемпературестекласосрезамибылиМатериалы и методики207депарафинизированы посредством инкубации в среде histo-clearII (ElectronMicroscopy Sciences, США) дважды по 5 мин. Затем стекла дваждыинкубировались в 96% этаноле по 2 мин и в свежем 96% этаноле в течение1 мин.
Далее срезы были высушены при комнатной температуре и хранилисьпри −800С.2.5.13.1. Лазерная микродиссекция образцовМикродиссекция проводилась с помощью системы PALM MicroBeam(Carl Zeiss, Германия). Визуализация срезов на мониторе компьютераосуществлялась через видеокамеру Axiocam ICc 1 (Carl Zeiss, Германия).Маркировка и вырезание (УФ-лазер, 350 нм) целевых областей срезовпроводилась с помощью программного обеспечения PALM Robo 43 (CarlZeiss, Германия). Вырезанный материал был катапультирован на адгезивнуюповерхность пробирок Adhesive Cap (Carl Zeiss, Германия). Всего быловырезано от 1700 до 4500 клеток на вариант.
Далее к собранному материалудобавлялся экстракционный буфер из набора PicoPure RNA Isolation Kit(Arcturus Engineering Inc., США) с последующим хранением при −80 °С довыделения тотальной РНК.2.5.14. Подготовка матрицы после лазерной микродиссекции дляэкспрессионного анализа2.5.14.1. Выделение тотальной РНК и амплификация РНКС помощью набора PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus EngineeringInc., США) в соответствии с протоколом производителя была выделенатотальнаяРНКизобразцов,полученныхспомощьюлазерноймикродиссекции. Для получения достаточного количества мРНК дляпроведения экспрессионного анализа была проведена амплификация РНК спомощью набора MessageAmp II aRNA Amplification kit (Ambion Inc., США).Концентрация аРНК была оценена с помощью системы электрофореза наМатериалы и методики208микрочипах для исследования нуклеиновых кислот MultiNA (ShimadzuCorporation, Киото, Япония).2.5.14.2.
Синтез кДНК и относительный ПЦР-анализ в режимереального времениПрепарат аРНК был использован в качестве матрицы для синтеза кДНКс помощью набора SuperScript reverse transcriptase III (Invitrogen, Карлсбэд,США). Для синтеза использовалось 300–500 нг аРНК на реакцию.
ПЦРанализ в режиме реального времени проводился с помощью iQ SYBR GreenSupermix (Bio-Rad, США), как описано выше.2.5.15. Количественныйанализэкспрессиитранскрипционныхрепортерных слияний lacZ и gusA4-х недельные клубеньки были собраны и растерты в 1 млохлажденного на льду буфера (0,25 M маннитол, 0,05 M Tris-HCl, pH 7.8) сдобавлением100 мгполивинилполипирролидона.Дляудалениянерастворимого осадка и обломков клеток, гомогенат был центрифугированпри 1000 rpm в течение 1 мин при 4 °C.
Надосадочная жидкость былаосторожно перенесена в новую пробирку и центрифугирована при 6000 rpm втечение 5 мин при 4 °C. После удаления надосадочной жидкости осадок,содержащий бактерии и бактероиды, был промыт и ресуспендирован в 1 млвышеописанногобуфераиоставленнальдудоиспользования.Специфическая активность β-галактозидазы была определена согласноМиллеру (Miller, 1972) как нМ o-нитрофенол x мин−1 x мг белка−1.Активность ß-глюкоронидазы определяли согласно Вильсону с соавт. (Wilsonet al., 1992), используя 4-нитрофенил ß-D-глюкуронид в качестве субстрата.Специфическая ß-глюкоронидазная активность определялась как нМ oнитрофенол x мин−1 x мг белка−1.
Суммарное содержание белка в образцахбыло определено по Бредфорду (Bradford, 1976).Материалы и методикиСпособность209бактериальныхсвободноживущемуростуклетокбылаклубенькаопреденавозвращатьсяподсчетомкчислаколониеобразующих единиц после посева серии разведений на чашки Петрис агаризированной средой TYG и инкубации при температуре 28-30 °C втечение 3-4 дней. Стабильность плазмид репортерных слияний определялиподсчетом числа колониеобразующих единиц, которые поддерживалиустойчивостькколичественногоантибиотикам,анализабыликодируемуюподтвержденыплазмидами.в3-хДанныенезависимыхэкспериментах.Для количественного анализа были использованы конститутивноэкспрессирующиеся слияния npt-lacZ и Tn5-gusA, так же как nodA-lacZ, dctAlacZ и fixNc-gusA (последнее слияние было использовано как контрольноеслияние с поздним бактериальным геном, индуцируемым микроаэробнымиусловиями).2.6.
Методики анализа влияния экзогенных гормонов, определениясодержания гормонов2.6.1. Анализ чувствительности тканей корня к экзогенномуауксинуСемена были стерилизованы концентрированной серной кислотой втечение 5 мин, промыты 3 раза стерильной водой и помещены на чашкиПетри со средой MSO (Murashige, Skoog, 1962). Проростки культивировалисьв уловиях 16/8 ч (день/ночь) фотопериода. 2-х недельные асептическиепроростки были использованы как источники корневых эксплантов.Экспланты корней были помещены на чашки Петри со средой MSO,содержащей 1 или 5 мг/л 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота).Чувствительность эксплантов к 2,4-D была проверена спустя 1 месяц, былиопределены процент формирования каллусов и эксплантов с некрозами.Материалы и методики2102.6.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
