Диссертация (1144724), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Поэтомуисследованиявданномнаправлении,особенносиспользованиемсравнительного анализа двух видов семейства Бобовых: гороха и M.truncatula, представляют большой интерес. Другим важным направлениемявляетсяизучениеизмененийврастительно-микробноминтерфейсе,сопровождающим развитие клубенька. В последние годы становится всеболее ясной роль активных форм кислорода в подобных изменениях (Brewin,2004).В течение длительного времени активно изучается фитогормональнаярегуляция формирования клубеньков, в частности этиленом (Guinel, Geil,2002; Guinel, 2015; Цыганова, Цыганов, 2015).
Поэтому представляетсяважным проведение исследований новых аспектов регуляции бобоворизобиального симбиоза со стороны этилена, в частности развитиямеристемы и старения клубенька.Несмотря на активное изучение, до сих пор остаются вопросы офункционировании системы авторегуляции клубенькообразования.
Так, неОбзор литературыясна природафактора,167продуцируемогостеблем,иингибирующегоклубенькообразование на корнях (Reid et al., 2011b). Кроме того, системаавторегуляции имеет общие компоненты с системой негативной регуляцииклубеньков нитратами. Поэтому представляется важным изучить отдельныеаспекты нитратного регулирования клубенькообразования у гороха.Особый интерес представляет анализ экспрессии ризобиальных геновна различных стадиях развития клубенька, что позволит выявить тонкуювзаимосвязьвкоординацииэкспрессиигеновкакмакро-,такимикросимбионтов.Для успешного развития клубенька ризобиям необходимо преодолетьсистему защиты со стороны растения (Иванова, Цыганов, 2014), поэтомуизучение защитных реакций, активируемых при симбиогенезе, особенно напоздних стадиях, представляется весьма актуальным.Большоезначениеимеетизучениемеханизмовстарениясимбиотического клубенька, как финальной стадии симбиогенеза.
Впоследние годы в данном направлении были достигнуты большие успехи длямодельных бобовых растений, связанные с изучением транскриптомов (Vande Velde et al., 2006; Maunoury et al., 2010; Cabeza et al., 2014; Chungopast etal., 2014). Поэтому представляется важным использование полученныхрезультатовдляизучениямеханизмовстаренияугороха,важнойсельскохозяйственной культуры.В связи с постоянным увеличением действия различных стрессоров наразвитие растений, в том числе на их взаимодействия с полезноймикрофлорой, важным представляется изучение механизмов адаптациибобовых растений к формированию клубеньков в стрессовых условиях.Кадмий и плотные почвы представляются адекватными модельнымистрессорами, действие которых на растения активно изучается (Hamza,Anderson, 2005; Verbruggen et al., 2009).
В то же время их влияние наОбзор литературы168формирование и функционирование азотфиксирующих клубеньков изученонедостаточно. Между тем, такого рода исследования могут представлятьбольшой практический интерес, например, при создании растительномикробных систем для фиторемедиации почв, загрязненных тяжелымиметаллами.Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕДОДИКИ2.1. Биологический материал2.1.1. Растительный материалИсследования проводились с использованием 3-х видов бобовыхрастений:важногодлясельскохозяйственногопроизводствагорохапосевного (Pisum sativum L.) и модельных видов лядвенца японского (Lotusjaponicus (Regel) K. Larsen) и люцерны слабоусеченной (Medicago truncatulaGaertn.).Дляпроведенияисследованийсиспользованиемгорохабылаиспользована серия генотипов дикого типа.
SGE (Kosterin, Rozov, 1993) иSprint-2 (Бердников et al., 1989) являются лабораторными линиями, а Finale,Frisson, Rondo, Sparkle — коммерческими сортами. Также в работе былииспользованы мутанты по симбиотическим признакам, полученные сиспользованием вышеуказанных генотипов (Таблица 1).Таблица 1. Симбиотические мутанты гороха, использованные вданном исследованииГенФенотипМутантные линииСсылкиsym7Nod−E69, RisNod14(Engvild, 1987;Kneen et al., 1994;Borisov et al., 2004)sym8=Nod−R19, R25, R80, RisNod10,RisNod13, RisNod19, RisNod21,RisNod25,(Engvild, 1987;Kneen et al., 1994;Borisov et al., 2004)sym20Sprint-2Nod−-1, Sprint-2Nod−-2sym9Nod−R72, P54(Duc et al., 1989;Kneen et al., 1994;Borisov et al., 2004)sym10Nod−P56(Engvild, 1987; Ducet al., 1989; Borisovet al., 2004)sym11Nod−N24(Kneen et al., 1994)Материалы и методики170sym12Nod+/−K5(Postma et al., 1988)sym13Fix−E135f(Kneen et al., 1990)sym14Nod−E135n, SGENod−–2(Kneen et al., 1990;Цыганов et al.,1999)sym15Fix−E151(Kneen et al., 1994)sym16Fix−R50(Kneen et al., 1994)sym17Nod+/−R82(Kneen et al., 1994)sym18Nod+/−E54(LaRue et al., 1996)sym19Nod−P6, NEU5, RisNod2,(Kneen, LaRue,1988; Duc et al.,1989; Borisov et al.,2004)sym21Nod+/−E132(Markwei, LaRue,1997)sym23Fix−P59(Duc et al., 1989;Borisov et al., 2004)sym24Fix−P60(Duc et al., 1989;Borisov et al., 2004)sym25Fix−P61, SGEFix−–8(Duc et al., 1989;Borisov et al., 2004);данная работаsym26Fix−P63, RisFixM, RisFixT, SGEFix−–3(Engvild, 1987; Ducet al., 1989; Borisovet al., 2004); даннаяработаsym27Fix−P12, RisFixQ, SGEFix−–7(Engvild, 1987; Ducet al., 1989;Tsyganov et al.,1999); даннаяработаsym31Fix−Sprint-2Fix−(Borisov et al., 1997)sym32Fix−RisFixL, RisFixO(Engvild, 1987;Morzhina et al.,2000)Материалы и методики171sym33Fix−RisFixU, SGEFix−–2, SGEFix−–5(Engvild, 1987;Tsyganov et al.,1998); даннаяработаsym34Nod−RisNod1, RisNod23, RisNod30(Engvild, 1987;Borisov et al., 2004)sym35Nod−RisNod8, SGENod−–1, SGENod−–3(Engvild, 1987;Цыганов et al.,1999)sym36Nod−RisNod24, RisNod26(Engvild, 1987;Borisov et al., 2004)sym37Nod+/−RisNod4, K24(Engvild, 1987;Borisov et al., 2004)sym38Nod−RisFixF, SGENod−–4, SGENod−–8(Engvild, 1987;Tsyganov et al.,1994; Borisov et al.,2004); даннаяработаsym39Nod+/−P57(Sagan et al., 1994;Borisov et al., 2004)sym40Fix−SGEFix−–1, SGEFix−–6(Tsyganov et al.,1998); даннаяработаsym41Fix−RisFixA(Engvild, 1987;Tsyganov et al.,2001); даннаяработаsym42Fix−RisFixV(Engvild, 1987;Tsyganov et al.,2001); даннаяработаCерия симбиотических мутантов гороха, индуцированных на сортеFinale,былалюбезнопредоставленаК.Ингвилдом(K.Engvild)(Национальная лаборатория Ризо, Роскилле, Дания), серия мутантов,индуцированных на сорте Sparkle — T.A.
Ларю (T.A. LaRue) (ИнститутМатериалы и методики172исследования растений Бойса Томпсона, Итака, США), симбиотическиемутантынасортеRondoЭ.—университет,(СельскохозяйственныйЯкобсеномВагенинген,(E.Jacobsen)Нидерланды).Врезультате в работе была использована самая представительная коллекциямутантов гороха по симбиотическим генам в мире.В исследованиях были использованы полученные в ходе выполненияданной работы мутанты гороха: SGEcrt, характеризующийся повышеннойчувствительностью к плотности субстрата (Tsyganov et al., 2000) (см.
раздел3.15), и SGECdt, характеризующийся повышенной уcтойчивостью к кадмиюи повышенной его аккумуляцией (Tsyganov et al., 2007) (см. раздел 3.13).В исследования были вовлечены исходная линия L. japonicus Gifu иполученные на ее основе Fix− мутанты по генам: Ljsym10, Ljsym12, Ljsym13,Ljsym43, Ljsym61, Ljsym67 любезно предоставленные Й. Стоугаардом (J.Stougaard) (Орхуский университет, Дания).Также были использованы линия дикого типа M.
truncatula A17 иполученные на ее основе Fix− мутанты Mtdnf-1 (Wang et al., 2010), Mtefd-1(Vernié et al., 2008), TR3 (Mtipd3) (Maunoury et al., 2010; Ovchinnikova et al.,2011).2.1.2. Штаммы клубеньковых бактерийПри отборе мутантов по симбиотическим признакам, проведениигенетического анализа, анализе проявления старения в симбиотическихклубеньках гороха, анализе этиленчувствительности и устойчивости книтратам симбиотических мутантов, анализе влияния хлорида кадмия иплотностиинокуляциисубстратарастенийнаспособностьклубеньковымикклубенькообразованиюбактериямибылдляиспользованпроизводственный штамм Rhizobium leguminosarum bv.
viciae CIAM1026 изколлекцииФГБНУВНИИСХМ(http://62.152.67.70/cryobank/login.jsp)Материалы и методики173(Safronova, Novikova, 1996). Инокуляцию проводили водной суспензиейбактерий при разведении 107–108 клеток на 1 растение.Для опытов по выявлению стадии развития симбиоза, блокированной умутантов, растения были инокулированы штаммом R. leguminosarum bv.viciae VF39 gusAconst, любезно предоставленным У.Б. Приефер (U.B.
Priefer)(Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена, Германия). Данныйштамм характеризуется конститутивной экспрессией гена gusA, которыйконтролирует синтез фермента β-глюкуронидазы. Использование данногоштамма позволяет, после специальной обработки, проследить развитиеинфекции по появлению характерного синего окрашивания, указывающегона присутствие ризобий.В опытах по изучению экспрессии бактериальных генов в клубенькахсимбиотическихмутантовгорохабылииспользованыштаммыR.leguminosarum bv. viciae, полученные на основе штамма VF39SM (Priefer,1989), несущие слияния исследуемых генов с репортерными генами lacZ иgusA:a) штаммы VF39 nodA–lacZ (Spaink et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
