Диссертация (1144724), страница 27
Текст из файла (страница 27)
FixLJ регулируют экспрессию гена nifA унекоторых видов ризобий, но не у R. leguminosarum.У R. leguminosarum штамма VF39 FixL содержит сенсорный домен,ковалентно связанный с воспринимающим доменом на С-конце. В то жевремя в геноме R. leguminosarum не был выявлен ген FixJ, что указывает наналичие дополнительных регуляторов (Boesten, Priefer, 2004).В качестве дополнительных регуляторов гена nifA у R. leguminosarumбыли предложены белки, кодируемые генами fnrN и fixK (Patschkowski et al.,Обзор литературы1541996). FixL является необходимым для микроаэробной индукции промотораfnrN в штамме VF39 (Рисунок 31) (Boesten, Priefer, 2004).
Штамм VF39, также, как и штамм 3841 имеет 2 копии оперона fixNOPQ: fixNOPQC и fixNOPQd(Schlüter et al., 1997; Young et al., 2006). Мутации как по гену fixL, так и погену fixK приводят к Fix+ фенотипу, хотя уровень азотфиксации был снижен.Делеция fnrN приводила к еще большому снижению уровня азотфиксации, вто время как у двойного мутанта fixK / fnrN нитрогеназная активность недетектировалась (Patschkowski et al., 1996).
Это может объясняться тем, чтоFixK является позитивным регулятором fnrN, но не является необходимымдля экспрессии fnrN. Также возможно, что FixK и FnrN функционируютпараллельно, координируя регуляцию дополнительных генов азотфиксации(Terpolilli et al., 2012).ПриисследованииштаммаUPM791былопоказано,чтовсимбиотических условиях экспрессия nifA происходит в основном с σ54зависимого промотора (PnifA1), расположенного выше генного кластераfixABCX nifAB (Рисунок 31). Для активности с промотора PnifA1 необходимоприсутствие NifA и в его отсутствии наблюдается только базовый уровеньэкспрессии с промотора PnifA2.
В отсутствие PnifA1 формировались частичноэффективные клубеньки, что совпадало с низким уровнем экспрессии вбактероидах nifA (Boesten, Priefer, 2004; Martínez et al., 2004). Таким образом,была показана авторегуляция nifA в штамме UPM791, независимая от FixL иFixK (Рисунок 31), но остается неясным, какие факторы регулируют nifA удругих штаммов R. leguminosarum.Обзор литературы155Рисунок 31.
— Путь регуляции экспрессии и активности NifA(мастер-регулятора азотфиксации) у R. leguminosarum bv. viciae VF39Красные стрелки символизируют гены, прерывистые стрелкипредставляют их транскрипцию. Черные стрелки иллюстрируют позитивную(+), или негативную регуляцию (-), соответственно. Серый прямоугольникобозначает авторегуляцию nifA, которая была показана у R. leguminosarumbv. viciae UPM791 (Terpolilli et al., 2012).1.2. Абиотические стрессы и их влияние на развитие клубеньков1.2.1. Кадмий, как один из наиболее токсичных тяжелых металловКадмий поступает в экосистемы как в результате естественныхпроцессов (извержения вулканов, выветривание горных пород), так и врезультатеантропогеннойметаллургическая,химическаядеятельностипромышленность,(горнодобывающая,транспорт,внесениеминеральных удобрений) (Титов et al., 2007).
При этом кадмий являетсяодним из наиболее распространенных и токсичных элементов, его эмиссия вокружающую среду с середины прошлого века до начала нынешнегосоставила 22000 тонн (Singh et al., 2003). Кадмий хорошо растворяется в водеОбзор литературы156и легко переносится по пищевым цепям, вызывая серьезные нарушенияжизнедеятельности у многих живых организмов (Sanità di Toppi, Gabbrielli,1999).Кадмий поступает в растения с помощью переносчиков металлов (цинка,железа) и кальциевые каналы.
Даже при низких концентрациях кадмия урастенийингибируютсярост,фотосинтез,дыхание,водныйобмен,минеральное питание и продуктивность (Титов et al., 2007).Большое сродство кадмия к тиольным группам белков, замена иономкадмия иона цинка и других ионов в связывающих сайтах белков можетвызывать ингибирование или изменение активности различных белков,вовлеченных в разнообразные процессы метаболизма, а также ингибироватьрепарацию ДНК (Clemens, 2006).
Конкуренция кадмия за сайты связывания скальцием может изменять некоторые кальций-кальмодулин зависимые путипередачи сигнала (Rivetta et al., 1997). Кадмий также негативно влияет нафункционирование элементов цитоскелета (Fusconi et al., 2007).Тем не менее, большинство растений характеризуется наличиемосновной устойчивости, а некоторые гиперустойчивостью (Clemens, 2001).Гиперустойчивость может реализовываться как за счет исключения кадмия,так и за счет его гипераккумуляции в наземной части растения вконцентрации в 100–1000 раз превышающей таковую у обычных растений(Clemens, 2006). Гипераккумуляция кадмия и гиперустойчивость к нему былиописаны только для четырех видов растений (Thlaspi caerulescens, Thlaspipraecox, Arabidopsis halleri и Sedum alfredii), которые также являютсягипераккумуляторами цинка, также к гипераккумуляторам кадмия иногдаотносят и Brassica juncea (Verbruggen et al., 2009).
Исследование механизмовгипераккумуляции кадмия представляет большой интерес для разработкитехнологий фиторемедиации почв, загрязненных кадмием (Peer et al., 2006).Обзор литературы157Обезвреживание поглощенных металлов может включать в себяразнообразные процессы, среди которых иммобилизация в клеточной стенке,образование комплексов с хелаторами, синтез стрессовых белков, синтезметаллотионеинов и фитохелатинов, активное выведение ионов тяжелыхметаллов из клетки, компартментализация. Следует отметить, что в основномданные механизмы вовлечены в проявление как основной, так игиперустойчивости к Cd.
Тем не менее, имеются определенные различия.Основная устойчивость возникает в результате компартментализации Cd,связанного с фитохелатинами или другими хелаторами, в вакуоли. При этомбóльшая его часть остается в корне, и лишь незначительная часть Cdпоступает в наземные органы. В возникновении гиперустойчивости синтезфитохелатинов не играет существенной роли (Ebbs et al., 2002), в то же времязначительно усилен транспорт Cd в ксилему, по которой он поступает вназемныеорганы,вкоторыхпроисходитегокомпартментализация(Hanikenne et al., 2008). Детально молекулярно-генетические механизмыустойчивости высших растений к кадмию рассмотрены нами ранее (Кулаева,Цыганов, 2010).1.2.2. Влияние кадмия на развитие симбиотических клубеньковВ пионерском исследовании влияния кадмия на функционированиеазотфиксирующих клубеньков у люцерны было показано, что кадмийприводит к значительному снижению нитрогеназной активности (на 71% на59-й день после инокуляции) при концентрации 18 мкМ Cd2+ и полномуингибированию при концентрации 900 мкМ Cd2+ (Huang et al., 1974).
Вданных экспериментах кадмий вносился на второй день после инокуляциипроростков. При добавлении же кадмия на 30-е сутки после инокуляциипроростков негативный эффект кадмия был менее выражен (Huang et al.,1974). Сходные результаты были получены позднее: при переносе 4-хнедельныхпроростковвводныйраствор,содержащийразличныеконцентрации кадмия, при концентрации 9 мкМ Cd2+ наблюдалось снижениеОбзор литературы158азотфиксирующей активности на 38%, а при концентрациях 90 и 900 мкМCd2+ наблюдалось полное ингибирование нитрогеназной активности (Porter,Sheridan, 1981).При исследовании растений M. sativa сорта Европа, инокулированныхклубеньковыми бактериями и выращенных в питательной среде с кадмием втечение двух недель, было показано, что клубенькообразование являетсянаиболее чувствительным параметром, по сравнению с другими ростовымипараметрами.
Так, число клубеньков снижалось на 50% при концентрациикадмия 5,8 мкМ, в то время как для снижения сырого веса корней на 50%требовалась концентрация кадмия более чем 20 мкМ (Neumann, Werner,2000).В исследованиях люпина белого, в которых растения были выращены вусловиях гидропонной культуры при концентрациях 18 и 45 мкМ Cd2+, былопоказано, что при концентрации 45 мкМ Cd2+ наблюдалось 50% снижениесодержания азота, 74% снижение числа клубеньков, 65% снижение биомассыклубеньков, однако вес единичного клубенька был увеличен на 45% (Zornozaet al., 2002). Концентрация 18 мкМ Cd2+ была использована для проведениядальнейших более детальных исследований.
Наблюдалось снижение посравнению с контролем биомассы клубеньков, среднего веса клубенька,содержания общего азота в растениях, водорастворимых белков в клубеньках(Carpena et al., 2003). Также наблюдалось снижение концентраций рядаэлементов в клубеньках, таких как: P, K, Ni. В то же самое времяконцентрации Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, B, Mo и Co не изменились. Происходилитакже изменения в гистологической и ультраструктурной организацииклубенька.
Было отмечено заполнение гликопротеинами межклеточныхпространств, а также деградация бактероидов в инфицированных клетках(Carpena et al., 2003).Обзор литературы159При исследовании влияния кадмия на азотфиксацию 4-х недельныерастения гороха были подвергнуты действию серии различных концентрацийCdCl2 (от 2,5 до 10 мМ) в течение 6-ти и 12-ти дней. При этом было показано,чтопринизкихазотфиксирующейконцентрацияхактивности(до5мМ)сопровождалосьуменьшениеобщейуменьшениеммассыклубеньков на растении.
В то же самое время негативный эффект кадмия наудельную азотфиксирующую активность (выраженную на грамм сырого весаклубеньков) был значительно менее выражен. При более высокихконцентрациях снижались как общая, так и удельная азотфиксирующиеактивности. Авторы сделали вывод, что при низких концентрациях кадмийснижает азотфиксирующую активность растения за счет влияния на процессформирования клубеньков, а при высоких — как за счет влияния наформирование клубеньков, так и за счет влияния на сам процессазотфиксации (Chugh et al., 1992).В более позднем исследовании было показано уменьшение числаклубеньков после 28-ми дневной обработки CdCl2 (4,5–50 мкМ), однако весклубенька, так же как и в случае люпина белого, увеличивался с ростомконцентрации кадмия (Hernandez et al., 1995).
Кадмий может влиять на рост иразвитие клубенька, уменьшая число клубеньков и массу клубеньков, как этобыло показано для растений фасоли, обрабатываемых 10–500 мкМ CdCl2 втечение 17-ти дней (Vigue et al., 1981).Исследования влияния серии концентраций кадмия на развитиесимбиотических клубеньков и азотфиксирующую активность у сои показало,что хотя число клубеньков снижалось уже при самых низких концентрацияхкадмия (2 мг/кг почвы), в то же самое время наблюдалась некотораястимуляция азотфиксирующей активности при концентрациях до 5 мг/кгпочвы (Chen et al., 2003).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
