Диссертация (1144724), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Компьютерный анализ (ClustalX)промоторной области данного гена выявил серию блоков консервативныхпоследовательностей, функциональная значимость которых может бытьопределена после делеционного анализа и сайт-направленного мутагенеза.Однако, две близлежащие к точке начала транскрипции последовательностив области −384…−352 нуклеотида у LjNin L.
japonicus и −385…−352нуклеотида у PsNin привлекают особое внимание, так как являются органспецифическимипоследовательностями,характернымидлядругогосимбиотического гена бобовых — леггемоглобина и позже найденными удругих генов, экспрессирующихся в клубеньках (Szczyglowski et al., 1994).Важно отметить, что часть одной из последовательностей, известная для A.thaliana является ауксин-зависимым элементом, взаимодействующим с ARF1траснкрипционным фактором (Ulmasov et al., 1997).Прочитанная последовательность клонированных фрагментов кДНКPsNin показала, что все четыре клона содержат разные фрагменты,соответствующей мРНК одного и того же гена гороха, гомологичного генуLjNin.
Два фрагмента содержали кДНК, соответствующую 3’ концу мРНК(поли-A «хвост»). Однако фрагментов с полноразмерной копией кДНК генаPsNin гороха клонировано с использованием имеющейся в наличии геннойбиблиотеки не было. Наибольший из клонированных фрагментов (RH2)содержал 2033 п.о. с 3’ концом. После сравнения размера секвенированногосегмента с мРНК LjNin было показано, что в результате проведенной работыклонировано и секвенировано около 2/3 от ожидаемой полноразмернойРезультаты и обсуждение259кДНК (Schauser et al., 1999). Также было показано, что секвенированныйфрагмент кДНК гена PsNin высокогомологичен (определено BLASTанализом) последовательности мРНК гена Nin L.
japonicus на уровнепоследовательности аминокислот (от 50% до 90% в различных участкахсеквенированного фрагмента). Недостающий (после скрининга кДНКбиблиотеки) 5' участок кДНК копии данного гена был изолирован сиспользованием5'RACE.Врезультатебылареконструированаисеквенирована полноразмерная копия кДНК. Сравнение структуры геномныхи кДНК копий данного гена гороха показало, что экзон/интронная структурагомологичных генов гороха и лядвенца весьма консервативна (Рисунок 39).На уровне нуклеотидной последовательности гомология составила 60%между кодирующими районами, тогда как большие сегменты (около стануклеотидов) демонстрируют более 80% гомологии.
На уровне аминокислотгомология составила около 60% (Рисунок 40).Для того, чтобы подтвердить, что ген PsSym35 является PsNin, областьразмером примерно 4000. п.н., покрывающая все экзоны и интроны PsNinбыла амплифицирована и секвенирована у 3-х аллельных мутантов по генуPssym35: SGENod−-1, SGENod−-3, RisNod8 (Рисунок 39). У всех 3-х мутантовбыли выявлены единичные нуклеотидные замены в гене PsNin, по сравнениюс последовательностями соответствующих генотипов дикого типа SGE иFinale. У SGENod−-1 (Pssym35) произошла замена C на T в положении 1657кодирующей последовательности, что привело к возникновению стоп-кодона(CAG на TAG) после D552.
У мутантной аллели SGENod−-3 (Pssym35)произошла замена C на T в положении 160 кодирующей последовательности,что привело к возникновению стоп-кодона (CAA на TAA) после P53. УRisNod8 (Pssym35) произошла замена G на A (GAG на AAG) в положении1210 кодирующей последовательности. Это привело к аминоксилотнойзамене глутаминовой кислоты на лизин в позиции 404 белка.Результаты и обсуждение260Таким образом, ген гороха PsSym35 клонирован как ортолог гена LjNin,ключевого регулятора симбиогенеза.
Тем самым осуществлен переход отмодельных бобовых растений к хозяйственно значимым бобовым культурам.Рисунок 39. — Структура аллелей дикого типа и мутантов уортологичных генов LjNin и Pssym35Результаты и обсуждение261Рисунок 40. — Сопоставление аминокислотных последовательностейбелков Nin L. japonicus и Sym35 P. sativum3.5. Анализролиарабиногалактанпротеин-экстензиноввреализации генетической подпрограммы инфекции тканей клубенькаризобиями у горохаСтенка инфекционной нити является продолжением растительнойклеточной стенки, содержащей этерифицированные и деэтерифицированныепектины, ксилоглюканы и целлюлозу (Rae et al., 1992).
Матриксинфекционной нити соответствует внеклеточному матриксу, и его основнымкомпонентомявляютсяАрабиногалактанпротеиныгликопротеины(Brewin,2004).составляют класс гликопротеинов, богатыхгидроксипролином (Cassab, 1998). Бобовые растения синтезируют сложныйкополимер, состоящий из повторяющихся арабиногалактанпротеинов иэкстензиновых мотивов (Rathbun et al., 2002; Brewin, 2004). Эти богатыетирозиномгликопротеины,называемыеарабиногалактанпротеин-экстензинами вовлечены в инфекционный процесс.Результаты и обсуждениеМАС265является262однимизантител,узнающихарабиногалактанпротеин-экстензины. Было показано, что в клубенькахгенотипов дикого типа SGE и Finale арабиногалактанпротеин-экстензины,узнаваемыеМАС265,являютсяглавнымикомпонентамиматриксаинфекционных нитей и инфекционных капель как в зоне инфекции, так и взоне азотфиксации (Рисунок 41Б, Рисунок 42А).У мутанта SGEFix−-1 (Pssym40) арабиногалактанпротеин-экстензины,узнаваемые МАС265, также присутствовали в матриксе инфекционных нитейи гипертрофированных инфекционных капель (Рисунок 41Г).
Однако, вотличие от исходной линии, метка МАС265 наблюдалась в межклеточномпространстве инфицированной ткани клубенька (Рисунок 41Г, Рисунок 42Б).У мутанта RisFixV (Pssym42) наличие МАС265 наблюдалось впросвете инфекционных нитей как обычного строения, так и инфекционныхнитей с аномально утолщенными клеточными стенками. Однако в некоторыхинфекционных нитях связывание антитела MAC265 отсутствовало в частиматрикса инфекционной нити (Рисунок 42Е).У мутанта SGEFix−-2 (sym33) и двойных мутантов RBT3 (Pssym33,Pssym40) и RBT4 (Pssym33, Pssym42) арабиногалактанпротеин-экстензины,выявляемые МАС265, присутствовали в просветах инфекционных нитей(Рисунок 41Е, Рисунок 42Д).
В то же время в некоторых инфекционныхнитях с электронно-плотным матриксом метка MAC265 отсутствовала(Рисунок 42В), при этом наблюдалась деградация ризобий внутри матрикса.Такжеумутантоварабиногалактанпротеин-экстензины,выявляемыеМАС265, присутствовали в межклеточных пространствах паренхимыклубенька. При этом у мутанта RBT3 (Pssym33, Pssym40) были выявленынебольшие транспортные везикулы, несущие арабиногалактанпротеинэкстензины, выявляемые МАС265, непосредственно рядом с плазматическоймембраной (Рисунок 42Г).Результаты и обсуждение263Рисунок 41.
— Иммунолокализация ЛПС (А, В, Д) иарабиногалактанпротеин-экстензинов (Б, Г, Е)Выявление с помощью антител МАС57 (для ЛПС R. bv. viceae 3841) иМАС265 (для арабиногалактанпротеин-экстензинов). А, Б — линия дикоготипа SGE; В, Г — мутантная линия SGEFix−-1 (Pssym40); Д, Е — двойнаямутантная линия RBT3 (Pssym33, Pssym40). ик — инфицированная клетка,ика — инфекционная капля, стрелки указывают на инфекционные нити,звездочка указывают на инфекционные нити с относительным отсутствиемметки МАС265 у двойной мутантной линии RBT3, наконечники стрелок —на локализацию МАС265 в межклеточном пространстве у мутантной линииSGEFix−-1. Масштабная линейка = 10мкм.Результаты и обсуждение264Рисунок 42. — Иммунолокализация антигена арабиногалактанпротеинэкстензина матрикса инфекционных нитей, меченного антителомМАС265(A) локализация метки МАС265 в просвете инфекционной нити линиидикого типа SGE; (Б) локализация метки МАС265 в межклеточномпространстве у мутантной линии SGEFix−-1 (Pssym40); (В) отсутствие меткиМАС265 в просвете инфекционной нити с утолщенными стенками умутантной линии SGEFix−-2 (sym33), (Г) транспортные везикулы, несущиеметку МАС265, вблизи плазматической мембраны инфицированной клетки умутантной линии RBT3 (Pssym33, Pssym40); (Д) локализация МАС265 впросвете инфекционной нити у мутантной линии RBT4 (Pssym33, Pssym42);(E) отсутствие арабиногалактанпротеин-экстензинов, меченных МАС265, вчасти матрикса инфекционной нити у мутантной линии RisFixV (Pssym42).
б— бактерия, ба — бактероид, кс — клеточная стенка, мкп — межклеточноепространство; наконечники стрелок указывают на транспортные везикулы,Результаты и обсуждение265стрелки указывают на частицы золота, конъюгированные с вторичнымиантителами. Масштабная линейка = 0,5 мкм.Арабиногалактанпротеин-экстензиныбобовыхрастенийявляютсявысоко гликозилированными растительными гликопротеинами (Rathbun etal., 2002). Арабиногалактанпротеин-экстензины выделяются как растворимыекомпоненты экстрактов корневых клубеньков (Bradley et al., 1988), ихмолекулярная масса 900-110кДа, и они распознаются моноклональнымантителом МАС265 (VandenBosch et al., 1989a; VandenBosch et al., 1989b).Ранее было показано, что арабиногалактанпротеин-экстензины локализуютсяв просвете инфекционных нитей, в которых бактерии находятся в матриксе,содержащем растительный гликопротеин (VandenBosch et al., 1989a; Rae etal., 1992; Rathbun et al., 2002). В данном исследовании в клубеньках растенийдикого типа и мутантов это антитело также распознавало инфекционныеструктуры как в зоне инфекции, так и в зоне азотфиксации.Втожевремя,уSGEFix−-1мутанта(Pssym40)арабиногалактанпротеин-экстензины, меченные MAC265, наблюдались вмежклеточных пространствах в зоне инфекции.
У одиночного и двойныхмутантов,несущихPssym33арабиногалактанпротеин-экстензины,выявляемые МАС265, присутствовали в межклеточных пространствахпаренхимы клубенька. При этом у двойного мутанта RBT3 (Pssym33,небольшиеPssym40)транспортныеарабиногалактанпротеин-экстензины,вблизиплазматическоймеченныемембраны.везикулы,MAC265,ПоявлениеметкинесущиенаблюдалисьМАС265вмежклеточном пространстве может быть связано с изменением направленнойсекреции арабиногалактанпротеин-экстензинов в результате нарушениянормальногоразвитиягликопротеиновинфекционныхматриксатесноинфекционной нити (Rae et al., 1992).нитей.коррелируетНаправленнаяссекрецияпроцессомростаРезультаты и обсуждениеВыявленные266нарушениянаправленнойсекрецииарабиногалактанпротеин-экстензинов могут быть связаны с существованиемрастительных«локасом»,которыеконтролируютполярныйростинфекционных нитей. Ратбун с соавт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
