Диссертация (1144724), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Это предположение было подтверждено сиспользованием мутанта SGEFix−–2 (Pssym33), который формирует широкие«запертые» инфекционные нити (Tsyganov et al., 1998), из которых лишьиногда происходит выход бактерий (Voroshilova et al., 2001). В мутантныхклубенькахмынаблюдалисдвигворганизациикортикальныхмикротрубочек от неупорядоченной в меристематических клетках кпоперечным параллельным пучкам в большинстве клеток с инфекционнымиструктурами, но в отдельных клетках, в которых происходил выходбактерий, кортикальные микротрубочки меняли свою ориентацию ипринимали неупорядоченный паттерн перекрещивающихся микротрубочек,типичный для меристематических клеток.
В клетках клубеньков мутанта M.truncatula TR3 (Mtipd3), в которых не происходил выход бактерий,ориентация кортикальных микротрубочек была сходной с таковой, котораянаблюдалась в клетках без выхода бактерий клубенька SGEFix−–2.Полученные результаты с мутантами по ортологичным генам Pssym33и Mtipd3 подтвердили, что данные гены могут прямо, или опосредовано,влиять на реорганизацию кортикальных микротрубочек в клубеньке.
Можнопредположить, что изменение в организации кортикальных микротрубочекможет быть активировано выходом бактерий, что может быть объясненоРезультаты и обсуждение300необходимостью для инфицированных клеток изменить их форму и объемдля размещения огромного количества бактероидов, заполняющих этиклетки.Выход бактерий связан с индукцией ряда растительных генов сведущей ролью в дифференцировке клеток клубенька.
Среди них большаягруппа генов, кодирующих специфичные для клубенька богатые цистеином(NCR) пептиды (Mergaert et al., 2003; Van de Velde et al., 2010), которыенапрямую влияют на дифференцировку бактериальных клеток после ихвыхода из инфекционных нитей (см.
раздел 1.1.12.1). Субклеточнаятранспортировка NCR пептидов нарушена у мутанта M. truncatula Mtdnf1–1,что приводит к тому, что вышедшие из инфекционных нитей бактерии недифференцируются в азотфиксирующие бактероиды IV, типичные для зоныIII клубеньков дикого типа (Van de Velde et al., 2010). Было выявлено, что винфицированных клетках клубеньков Mtdnf1–1 после выхода бактериймикротрубочки быстро деполимеризовались. Это является дополнительнымдоказательством того, что дифференцировка растительной клетки тесносвязана с дифференцировкой бактерий и/или их функционированием.
Ранеене было описано растительных или бактериальных мутантов с нарушениямив развитии клубенькообразования у которых наблюдалось бы такое быстроеисчезновениемикротрубочек.Недавнобылопоказано,чтовинфицированных клетках клубеньков мутанта Mtdnf1–1 не формироваласьактиновая сеть вокруг симбиосом (Gavrin et al., 2015).
В то же время, вотличие от клубеньков мутанта Mtdnf1–1, в клубеньках гороха Sprint-2Fix−(Pssym31), который несет мутацию в неортологичном гене, но такжехарактеризуется недифференцированными бактероидами (Borisov et al.,1997), микротрубочки формировали плотную сеть, сходно клубенькамдикого типа. Поэтому можно предположить, что изменения в организациимикротрубочекмогутбытьсвязанысоспецифичнымиэтапамивдифференцировке бактероидов, или могут отражать межвидовые различияРезультаты и обсуждение301между горохом и M.
truncatula, что может быть проверено, когда станетдоступным мутант гороха по гену, ортологичному гену Mtdnf1–1.Позиционирование и морфология бактероидов в зоне азотфиксациигороха и M. truncatula различаются. У M. truncatula удлиненные бактероидыв основном располагаются перпендикулярно клеточной стенке, в то времякак у гороха Y-образные бактероиды расположены случайным образом.Ранее описанная дезорганизация эндоплазматических микротрубочек в IIзоне клубеньков M. truncatula (Timmers et al., 1998) не была подтверждена вданном исследовании. Это различие может объясняться различиями впротоколах фиксации и иммунолокализации, которые в данном исследованиипозволили более точно локализовать микротрубочки.
В зоне III клубеньковM. truncatula эндоплазматические микротрубочки были хорошо различимы,они располагались параллельно бактероидам. В то же время в клубенькахгороха эндоплазматические микротрубочки не претерпевали реорганизации ине формировали упорядоченный паттерн в тесном контакте с бактероидами.Данная клеточная организация, наблюдаемая в клубеньках гороха, былаописана для клубеньков люпина (Fedorova et al., 2007) и сои (Whitehead et al.,1998) и, таким образом, она является более общим типом организациимикротрубочек в зоне III.К настоящему моменту точные механизмы, лежащие в основераспределениясимбиосомпоинфицированнойклеткевходееедифференцировки не выяснены. Для ЭПР было показано, что в его динамикеосновную роль играют актиновые микрофиламенты (Chen et al., 2012;Griffing et al., 2017).
В то же время было показано, что растения используютмикротрубочки для фиксации ЭПР и удлинения его канальцев, что позволяетустанавливать тонкую сеть ЭПР внутри клетки (Hamada et al., 2014; Stefano etal., 2014). На основе наших исследований можно предположить, чтотубулиновый цитоскелет вовлечен в организацию клеточной цитоплазмы,создавая в ней условия для размещения симбиосом. Движение же симбиосом,вероятно, осуществляется за счет актиновых микрофиламентов. В то жеРезультаты и обсуждение302время было показано, что органеллы, окруженные мембраной, могутфизически взаимодействовать с другими органеллами.
Взаимодействиемежду двумя компартментами может, в свою очередь, контролироватьдвижение обеих взаимодействующих органелл. Было предположено, чтодвижение АГ, в свою очередь, приводит к движению ЭПР в растительныхклетках (Moreau et al., 2006; Sparkes et al., 2009). Такой механизм не можетбыть исключен и для движения симбиосом.Возникает важный вопрос о биологической значимости выявленныхразличий в клеточной организации между различными видами бобовыхрастений. До настоящего момента не было выявлено видимой связи междуморфологией бактероидов и их азотфиксирующей способностью (Bonaldi etal., 2011).
К настоящему моменту, не было опубликовано никакихисследований о роли расположения бактероидов в клубеньках M. truncatula.Тем не менее, принимая во внимание постулат, что форма соответствуетфункции, можно предположить, что клеточная организация в клубеньках M.truncatula является результатом эволюционного преимущества, котороеможет коррелировать с эффективностью обмена метаболитами междумикросимбионтамиирастением-хозяином.Проведениедальнейшегосравнительного анализа необходимо для расширения наших представлений офизиологии процесса азотфиксации в клубеньках бобовых растений сразличной клеточной организацией.3.8.
Анализ роль этилена в реализации ранних и поздних этаповгенетической программы симбиогенеза у горохаВ исследование были включены следующие мутанты, блокированныена различных стадиях развития симбиоза: K5 (Pssym12), SGEFix−-2(Pssym33), RisNod4 (Pssym37), SGENod−-8 (Pssym38), P57 (Pssym39),SGEFix−-1 (Pssym40), RisFixA (Pssym41) и SGENod−-7 (мутантный локус неидентифицирован), а также линия дикого типа SGE (Таблица 1).Результаты и обсуждение303Растения подвергались обработке ингибиторами синтеза и действияэтилена, а также этефоном — веществом, разлагающимся с образованиемэтилена и предшественником этилена АЦК.Вовремясъемаэкспериментабылипроанализированытакиепараметры как: число клубеньков, вес клубеньков, вес 1 клубенька.Было показано, что обработки не привели к изменениям в проявленияхNod− (отсутствие клубеньков) и Nod+/− (отдельные клубеньки) мутантныхфенотипов у линий: RisNod4 (Pssym37), SGENod−-8 (Pssym38) и P57(Pssym39).
Мутантные линии SGEFix−-2 (Pssym33), SGEFix−-1 (sym40), также,как и линия дикого типа SGE, характеризовались сходной реакцией наобработки: повышением числа клубеньков при воздействии ионов серебра, иснижением числа клубеньков при действии этефона. Следует отметить, чтонегативная реакция на этефон у мутантной линии SGEFix−-2 (Pssym33) былавыражена сильнее, чем у линии дикого типа и мутантной линии SGEFix−-1(Pssym40).
Для мутанта RisFixA (sym41), характеризующегося фенотипомNod+/− было показано некоторое увеличение числа клубеньков в варианте сингибитором действия этилена (с 1,0 до 3,4 клубенька на растение), такжепозитивный эффект ионов серебра был показан для мутанта SGENod−-7,которой проявил способность формировать отдельные клубеньки, но необразовывал клубеньков в контрольном варианте.Самый выраженный эффект наблюдался для мутантной линии К5(Pssym12),котораяпосравнениюссортомдикоготипахарактеризовалась снижением числа клубеньков, которые приRondoэтомформировались только на боковых корнях (Таблица 24). Ингибитор действияэтилена приводил к увеличению числа формируемых клубеньков у К5(Pssym12) до уровня дикого типа, а обработка этефоном, напротив,полностью ингибировала способность к клубенькообразованию, в то времякак у дикого типа, этефон лишь уменьшил число формируемых клубеньков.Дальнейшие эксперименты, в ходе которых наряду с действием ионовсеребра и этефона было также проверено действие ингибитора синтезаРезультаты и обсуждение304этилена (аминоэтоксивинилглицина) и предшественника этилена в егобиосинтезе(1-аминоциклопропан-1-карбоновойкислоты)подтвердилиполученные результаты (Таблица 24, Рисунок 61).При изучении развития инфекции у мутанта К5 (Pssym12) былопоказано,чтоформированиячастьинфекцийпримордияблокировалось(Рисунок62А),нараннихбольшинствоэтапахинфекцийостанавливалось после формирования зрелого примордия, на стадииформирования клубеньковой меристемы (Рисунок 62Б), в том случае, когдаредкиеинфекцииуспешноразвивались,формирующиесяклубенькихарактеризовались нормальной гистологической организацией (Рисунок62В).Таким образом, показано, что мутантная линия K5 (Pssym12),блокированная на стадии формирования меристемы зрелого клубенька,характеризуется повышенной чувствительностью к этилену.Висследованиябыливовлеченыдваранееописанныхэтиленчувствительных мутанта по генам Pssym5 и Pssym16 (Guinel, LaRue,1991; Guinel, Sloetjes, 2000).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
