Диссертация (1144724), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Влияние экзогенных нитратов на число клубеньков улинии дикого типа Gifu и Fix− мутантов L. japonicusГенотипФенотипКоличество клубеньков на растенииКонтрольЭкзогенныйнитрат24±10 W,Gifuкрупные розов. клубеньки43±10 X, YLjsym10мелкие белые клубеньки136±26X145±25WLjsym12розовые клубеньки10±4Y14±3Ljsym13бел. и роз. клубеньки43±10 C82±11 C, ZLjsym61мелкие белые клубеньки27±4 D41±11 D, VLjsym67мелкие белые клубеньки39±10B24±6BZ, VСредние значения, отмеченные одинаковыми буквами, статистическидостоверно различаются (Р>0,95).Был проведен анализ влияния экзогенных нитратов на общую массуклубеньков (Таблица 27) и на массу одного клубенька (Таблица 28). Данныео мутантах по генам Ljsym10 и Ljsym67 в таблицах не представлены, так какразмер клубеньков этих мутантов меньше 1мм и их сбор не представлялсятехнически возможным.
Растения мутанта по гену Ljsym12 и линии дикоготипа формировали клубеньки одинакового веса (Таблица 27), однако,поскольку количество клубеньков у дикого типа было больше, то и общаямасса клубеньков у дикого типа была выше, чем у мутанта.
Растениямутантов по генам Ljsym13, Ljsym61 формировали клубеньки меньшего весапо сравнению с линией дикого типа и мутантом по гену Ljsym12 (Таблица27). При этом следует отметить, что экзогенные нитраты не повлияли намассу одного клубенька, как у растений дикого типа, так и у мутантов погенам Ljsym12 и Ljsym61. В то же время обработка нитратами стимулировалаобщую массу клубеньков у мутантов по генам Ljsym12 и Ljsym61, что былосвязано с увеличением числа формируемых клубеньков (Таблица 26).Результаты и обсуждение315Таблица 27.
Влияние экзогенных нитратов на общую массуклубеньков у линии дикого типа Gifu и Fix− мутантов L. japonicusГенотипСухая масса клубеньков, мгКонтрольЭкзогенный нитратGifu10±4X,Y, Z, V7±5KLjsym122±1A, X3±1ALjsym133±1B,Y5±2BLjsym611±0C, V2±1C, KСредние значения, отмеченные одинаковыми буквами, статистическидостоверно различаются (Р>0,95).Таблица 28. Влияние экзогенных нитратов на массу одногоклубенька у линии дикого типа Gifu и Fix− мутантов L. japonicusГенотипСухая масса клубеньков, мкгКонтрольЭкзогенный нитратGifu278±52X, Y, Z260±63K, LLjsym12219±52288±51Ljsym1381±10A, X108±16A, KLjsym6138±5Z45±19LСредние значения, отмеченные одинаковыми буквами, статистическидостоверно различаются (Р>0,95).Также было проанализировано влияние экзогенных нитратов на сухуюбиомассу стеблей растений.
Было показано что, у растений дикого типанитраты не оказали влияние на биомассу, а у мутантов по генам Ljsym10,Ljsym12, Ljsym13, Ljsym61, Ljsym67 произошло увеличение приростабиомассы (Таблица 29). Отсутствие прибавки биомассы у растений линиидикого типа при добавлении экзогенного нитрата может объяснятьсяважностью симбиотрофного типа питания для L. japonicus. Необходимоотметить, что биомасса у мутантов по генам Ljsym61 и Ljsym67 меньшеРезультаты и обсуждение316приблизительно в 2 раза по сравнению с биомассой у мутантов по генамLjsym10 и Ljsym12 в контроле и в 1,25-3 раза при обработке экзогенныминитратами.
Вероятно, это связано с тем, что мутации в генах Ljsym61 иLjsym67 влияют не только на образование клубеньков, неспособныхфиксировать атмосферный азот, но и на развитие растения в целом, т.е.характеризуется плейотропным эффектом.Таблица 29. Влияние экзогенных нитратов на биомассу стеблейрастений у линии дикого типа Gifu и Fix− мутантов L. japonicusГенотипСухая биомасса стеблей растений, мгКонтрольЭкзогенный нитратGifu193±28X,Y, Z, K, M197±26N, O, P, Ssym1027±8C,X152±24Csym1232±8B,Y54±10B, Nsym1317±3D, Z119±22D, Osym615±2F, K35±8F, Psym6713±3A,M40±8A, SСредние значения, отмеченные одинаковыми буквами, статистическидостоверно различаются (Р>0,95).Таким образом, в ходе проведенных исследований с использованиемдвух видов бобовых растений, формирующих детерминированные клубеньки(L.
japonicus) и недетерминированные (горох), было показано, что рядмутаций,приводящихингибирующийНечувствительностькэффекткнеэффективномунитратовнитратамгенасимбиозу,наPssym31,влияютнаклубенькообразование.характеризующегосянедифференцированными бактероидами, указывает на связь процессадифференцировки клубенька и системного контроля клубенькообразованияза счет нитратной регуляции.Результаты и обсуждение3173.10. Изучение изменений в характере экспрессии генов Rhizobiumleguminosarum bv. viciae при реализации генетической подпрограммыинфекции тканей клубенька ризобиями у гороха3.10.1. Анализ экспрессии поздних симбиотических генов R.leguminosarum bv.
viciae nifA, fnrN и fixN в клубеньках серии Fix−мутантов горохаВсе три штамма R. leguminosarum bv. viciae, несущих слияния геновfnrN, nifA и fixN с репортерным геном gusA, формировали клубеньки накорнях линий дикого типа и мутантных линий, сходные с клубеньками,формируемыми при инокуляции штаммом дикого типа. При этом паттернэкспрессии проанализированных генов был сходен между собой.В клубеньках проанализированных генотипов дикого типа Sprint-2,SGE (Рисунок 65К), Sparkle и Finale (Рисунок 66А) экспрессия генов fnrN,nifA и fixN отсутствовала в меристеме и зоне инфекции, она наблюдаласьлишь в клетках зоны азотфиксации.При анализе аллельных мутантов по гену Pssym33 (SGEFix−–2 иRisFixU),формирующихнеэффективныеклубенькисзамкнутымиинфекционными нитями не было выявлено экспрессии генов fnrN, nifA и fixNR.
leguminosarum bv. viciae в клубеньках (Рисунок 65Б). В то же время вотдельных клетках мутантной линии SGEFix−–2 (Pssym33) наблюдался выходбактерий в цитоплазму растительной клетки из инфекционных капель, и втаких клетках наблюдалась экспрессия проанализированных бактериальныхгенов (Рисунок 65Л).
Таким образом, было показано, что поздние гены fnrN,nifA и fixN не экспрессируются клетками бактерий, находящимися винфекционных нитях, а активируются после выхода бактерий в цитоплазмурастительной клетки.У мутантной линии SGEFix−–1 (Pssym40), формирующей клубеньки снарушеннойгистологическойзональностьюигипертрофированнымиинфекционными каплями, экспрессия генов fnrN, nifA и fixN наблюдалась вРезультаты и обсуждение318клетках гистологической зоны, соответствующей зоне азотфиксации вклубеньках линии дикого типа (Рисунок 65Г).У мутанта Sprint-2Fix− (Pssym31), формирующего клубеньки снедифференцированными бактероидами, был выявлен градиент экспрессиигенов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarum bv.
viciae. Экспрессия анализируемыхгенов активировалась в дистальной части зоны, соответствующей зонеазотфиксациив клубенькахлинии дикоготипа, ноинтенсивностьокрашивания значительно возрастала к основанию клубенька (Рисунок 65Е).Таким образом, было предположено, что клубеньковые бактерии достигаютсостояния, определяющего максимум экспрессии поздних симбиотическихгенов, по мере продвижения клеток к основанию клубеньков, формируемыхмутантом Sprint-2Fix− (Pssym31).У мутантной линии RisFixO (Pssym32), также характеризующейсяформированием неэффективных клубеньков с недифференцированнымибактероидами не было выявлено экспрессии бактериальных генов fnrN, nifA иfixN (Рисунок 66Б).
Лишь в отдельных клубеньках было показано слабоеокрашивание, свидетельствующее об очень низком уровне экспрессииданных генов. Таким образом, в случае мутации в гене Pssym32 растенияобразуют неэффективные клубеньки, в клетках которых бактерии недостигают состояния, необходимого для инициации экспрессии позднихсимбиотических генов.В клубеньках мутантов E135f (Pssym13) (Рисунок 65З), RisFixM(Pssym26) (Рисунок 66В), RisFixТ (Pssym26) (Рисунок 66Г), RisFixQ(Pssym27) (Рисунок 66Рисунок 65Д) и RisFixV (Pssym42) (Рисунок 66Е),характеризующихсяпреждевременнойдеградациейсимбиотическихструктур, паттерн экспрессии бактериальных симбиотических генов fnrN,nifA и fixN был сходен с таковым в клубеньках соответствующих генотиповдикого типа.
Однако в зоне старения у мутантов наблюдался мозаичныйРезультаты и обсуждение319характер экспрессии данных бактериальных генов, который определяетсяразрушением симбиосом в клетках растения.Проведенный анализ уровней экспрессии поздних бактериальныхсимбиотических генов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarum bv. viciae вклубеньках гороха дикого типа и мутантах, блокированных на позднихстадиях развития симбиоза, показал, что экспрессия данных геновотсутствует в инфекционных нитях и зоне инфекции. Ранее у S. meliloti былопоказано, что для индукции генов fixK, nifA и fixN важным условием являетсяснижение парциального давления кислорода, и экспрессия этих генов вклубеньках M.
sativa наблюдается только в зоне азотфиксации (Soupène et al.,1995). Сходный паттерн экспрессии генов fnrN и fixN R. leguminosarum bv.viciae наблюдался в клубеньках растений вики (Schlüter et al., 1997).Таким образом, нами было показано, что наряду с низким парциальнымдавлением кислорода, выход бактерий в цитоплазму растительной клеткиявляется необходимым условием для индукции экспрессии генов fnrN, nifA иfixN R. leguminosarum bv. viciae в процессе формирования азотфиксирующегоклубенька гороха.
Что указывает на важную роль гена гороха PsSym33,контролирующего выход бактерий в цитоплазму растительной клетки.Ранее было показано, что в клубеньках мутантной линии Sprint-2Fix−(Pssym31) наблюдалось постепенное снижение парциального давлениякислорода, в отличие от его резкого снижения в дистальной части зоныазотфиксации в клубеньках дикого типа (Romanov et al., 1995). Данный фактможет объяснить наблюдаемый в ходе данного исследования градиентэкспрессии генов fnrN, nifA и fixN R.
leguminosarum bv. viciae, и максимумэкспрессии этих генов в основании клубенька, вероятно, соответствуетмаксимуму снижения парциального давления.Результаты и обсуждение320Рисунок 65. — Экспрессия конститутивно экспрессирующегося слияниягена Tn5–gusA (А, В, Д, Ж, И) и репортерного слияния fixN–gusA (Б, Г, Е,З, К, Л) в клубеньках Fix− мутантов гороха(A, Б, Л) SGEFix−–2 (Pssym33), (В, Г) SGEFix−–1 (Pssym40), (Д, Е)Sprint-2Fix− (Pssym31), (Ж, З) E135f (Pssym13), (И, К) SGE (дикий тип).
I —зона меристемы; II — зона инфекции; III — зона азотфиксации, III’ — зона вмутантном клубеньке, соответствующая зоне азотфиксации у дикого типа,стрелки указывают на инфекционные нити. Масштабная линейка = 0,4 мм.Результаты и обсуждение321Рисунок 66. — Экспрессия fnrN–gusA репортерного слияния вклубеньках дикого типа Finale и Fix− мутантов(A) Finale, (Б) RisFixO (Pssym32), (В) RisFixM (Pssym26), (Г) RisFixT(Pssym26), (Д) RisFixQ (Pssym27), (Е) RisFixV (Pssym42). I — зонамеристемы; II — зона инфекции; III — зона азотфиксации, III’ — зона вмутантном клубеньке, соответствующая зоне азотфиксации у дикого типа, IV— зона старения.
Масштабная линейка = 0,4 мм.В отличие от мутанта Sprint-2Fix− (Pssym31) в клубеньках мутантнойлинии RisFixO (Pssym32), экспрессия генов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarumbv. viciae не наблюдалась, либо присутствовала на очень низком уровне. Темне менее, ранее было показано, что, у мутанта RisFixO (Pssym32) степеньдифференцировки бактероидов выше, чем у линии Sprint-2Fix− (Pssym31)(Novák et al., 1995; Morzhina et al., 2000). Таким образом, наблюдаемоеразличиевэкспрессииизучаемыхбактериальныхгеновнеможетРезультаты и обсуждение322определяться различиями в уровне дифференцировки бактероидов междумутантными линиями. Можно предположить, что мутация в гене Pssym32может приводить к нарушению кислородного барьера в мутантныхклубеньках, либо она влияет на дополнительную регуляцию позднихбактериальных симбиотических генов.3.10.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
