Диссертация (1144700), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Таким образом, генетические подходы приидентификации прионов могут быть неэффективны. Для решения поставленных вработе задач мы разработали метод идентификации амилоидов, основанный назнании их универсальных биохимических свойств.3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»Приразработкеметодапротеомногоскринингаиидентификацииамилоидов, названного нами PSIA (Proteomic Screening for Identification ofAmyloid proteins) мы основывались на предложенном ранее подходе повыделению и очистке высокомолекулярной фракции детергент-устойчивыхбелковых агрегатов, обогащѐнной амилоидами [Kushnirov et al., 2006].
Длявыявления и идентификации в этой фракции любых, даже минорных белков,формирующих амилоидные агрегаты, мы разработали схему экспериментов,объединяющуюнесколькобиохимическихипротеомныхметодов,иапробировали еѐ на примере выявления уже известных дрожжевых прионов[PIN+] и [PSI+].Методика включает три основных этапа:1) Выделение и очистка при помощи серии ультрацентрифугированийбелковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами.1272) Разделениефракциибелков,формирующихдетергент-устойчивыеагрегаты, при помощи двумерного электрофореза белков, связанных сфлуорохромами.3) Выделение окрашенных белков из геля, трипсинолиз и идентификация спомощью масс-спектрометрии.Выделение белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты, в клеткахштамма GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенного деривата GT409 [psi-][pin-] былопроведено как описано в главе «Материалы и методы».
Детергент-устойчивуюфракцию белковых агрегатов растворяли в буфере, содержащемагенты,анерастворимыевбуферебелковыеагрегатыхаотропныеотделялицентрифугированием. Растворимые в буфере белки из штамма [PSI+][PIN+]окрашивали красным флуорохромом Cy5, а из штамма [psi-][pin-] зелѐнымфлуорохромом Cy3. На следующем этапе белки, выделенные из обоих штаммов,смешивали и разделяли методом двумерного гель-электрофореза. На рис 19А и19Б представлены результаты выделения белковых агрегатов, устойчивых кобработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, соответственно.
Необходимостьиспользования саркозината связана с тем, что некоторые амилоиды неустойчивык обработке SDS, но не растворяются при использовании более мягкихдетергентов [Urakov et al., 2010; Coalier et al., 2013]. Белкам, представленным вобоих штаммах, соответствуют жѐлто-зелѐные сигналы, тогда как белки,образующие агрегаты исключительно в штамме [PSI+][PIN+], окрашены краснымцветом. Красные пятна, как в случае обработки SDS, так и при обработкесаркозинатом, были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии какбелок Rnq1 – детерминант приона [PIN+] (данные спектрометрии представлены втаблицах 14 и 15). В обоих случаях белку Rnq1 соответствовали несколькосигналов, различающихся по изоэлектрической точке, но не по массе.
Это можетбыть связано с посттрансляционными модификациями белка Rnq1. Белкам,формирующим агрегаты, устойчивые к 1% SDS как в штамме [PSI+][PIN+], так и вштамме [psi-][pin-], соответствовали жѐлтые сигналы, образующиеся в результате128наложения флуорохромов Cy3 и Cy5. Этим сигналам соответствовали белки Gas1,Ape1 и Ape4 (рис. 19 А; таблица 14).Белки Gas1, Ape1 и Ape4 были выявлены также при обработке фракциибелковых агрегатов 3% саркозинатом натрия (рис.
19Б; таблица 15). Эти белкилибо образуют конститутивные амилоидные полимеры в дрожжах, либоформируют детергент-устойчивые агрегаты неамилоидной природы. В результатеобработки белковых агрегатов саркозинатом, который является более мягкимдетергентом в сравнении с SDS, на геле выявляется гораздо больше жѐлтыхсигналов, которым соответствуют белки, образующие агрегаты в штаммах[PSI+][PIN+]и[psi-][pin-].Существеннаячастьэтихбелков,являютсякомпонентами 20S субъединицы протеасомы (рис.
19Б; таблица 15). К нимотносятся все белки семейства Pre, а также белки Pup3 и Scl1 (SGD,http://www.yeastgenome.org). Очевидно, этот белковый комплекс не имеетотношения к амилоидам, но демонстрирует устойчивость к обработке 3%саркозинатом натрия. Важно отметить, что наличие относительно большогоколичества белков не мешает выявлению прионов, поскольку использованиеразноцветных флуорохромов позволяет чѐтко выявлять белки, формирующиеагрегаты исключительно в прионсодержащем штамме. Отметим, что белок Sup35,образующий прионные агрегаты в штамме [PSI+][PIN+], не выявлен с помощьюдвумерных электрофорезов (рис. 19 А и 19Б). Мы показали, что Sup35 выявляетсяв штамме [PSI+][PIN+], во фракции белковых агрегатов, нерастворимых в буфередля двумерного электрофореза.
Белки из этой фракции, выделенные из опытногои контрольного штаммов, были денатурированы кипячением в 2% SDS,разделены с помощью одномерного гель-электрофореза и визуализированыокрашиванием кумасси R250. Полоска, представленная исключительно в штамме[PSI+][PIN+] (рис.19В), была идентифицирована масс-спектрометрией как белокSup35 (таблица 16).129Рисунок 19. Белки, формирующие детергент-устойчивые агрегаты в штаммахGT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-]. А - Изображение двумерного гельэлектрофореза белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты. Белки из штаммовGT81-1C[PSI+][PIN+]иGT409[psi-][pin-]окрашеныфлуорохромамиCy5(красный) и Cy3(зелѐный), соответственно. Б – Изображение двумерного гельэлектрофореза белков, образующих саркозинат-устойчивые агрегаты.
Белки изштаммов GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] окрашены флуорохромамиCy5(красный) и Cy3(зелѐный), соответственно. В – Изображение одномерногоэлектрофореза, белков, образующих SDS-устойчивые агрегаты, нерастворимые вбуфере с хаотропными агентами.130Таким образом, мы показали, что прионные агрегаты Sup35 демонстрируютвысокий уровень устойчивости к обработке хаотропными агентами (8 Mмочевина, 2 M тиомочевина и 4% CHAPS).Таблица 14. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующихSDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-](рис.
19A).БелокСчѐт1Идентифицирован Идентифицированв штаммев штамме[PSI+][PIN+][psi-][pin-]Ape1126++Ape493++Gas1151++Rnq1*109+-Примечания:1Здесь и далее - счѐт – показатель, отражающий достоверность идентификациибелка (см. «Материалы и методы»). Указан счѐт, с которым былиидентифицированы белки в образце из штамма GT81-1C [PSI+][PIN+].* Белок выявлен и идентифицирован только в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+](Здесь и далее для таблиц 14 -17).131Таблица 15. Идентификация методом масс-спектрометрии белков, формирующихагрегаты, устойчивые к обработке саркозинатом натрия, в штаммах GT81-1C[PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19Б).БелокСчѐт1Идентифицирован вИдентифицирован вштамме [PSI+][PIN+]штамме[psi-][pin-]Ape1271++Ape4263++Gas1190++Pre178++Pre242++Pre399++Pre469++Pre6158++Pre7100++Pre8190++Pre9104++Pup2164++Pup3101++Put2101++Rnq1*73+-Scl1186++Примечания те же, что к таблице 14.132Таблица 16.
Идентификация белков, выявленных на одномерном электрофорезе вштаммах GT81-1C [PSI+][PIN+] и GT409 [psi-][pin-] (рис. 19В), методом массспектрометрии.Счѐт1БелокИдентифицированвИдентифицированвштамме штамме[PSI+][PIN+][psi-][pin-]Nop1160++Rpl28130++Rpl388++Rps2666++Sup35*143+-Tef2129++Примечания те же, что к таблице 14.Несмотря на эффективность и удобство для демонстрации результатов, этотметод имеет определѐнные ограничения:1) Белки с экстремальной изоэлектрической точкой (ниже 3,5 и выше 9,5)не разделяются с помощью двумерного электрофореза и выпадают изанализа;2) Белки, которые продуцируются на крайне низком уровне, могут, недетектироваться на геле.Для того, чтобы повысить разрешающую способность методики, мыотказались от использования двумерного электрофореза.
Фракцию белков,образующих агрегаты устойчивые к обработке 1% SDS при комнатнойтемпературе, выделяли так же как описано выше.133Таблица 17. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в штаммах GT81-1C[PSI+][PIN+] и GT409[psi-][pin-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDI,БелокСчѐт массИдентифицирован Идентифицированспектрометрии, в штамме [PSI+]в штамме [psi-]отражающийдостоверностьидентификации1869Sup35*+Gas1623++Tif1559++Sis1551+485Rnq1*+Ecm33438++Rim1406++Toh1376++Plb1355++Gas5316++Gas3292++222+Ssb1*204+Ssb2*Ape1195++Ilv2174++Ira1147++Utp20126++YBL100W-B110++Mlp1110++103+Ssa2*Примечания те же, что к таблице 14.Указаны показания счѐта масс-спектрометрии для образца из штамма GT81-1C[PSI+][PIN+].На следующем этапе белки растворяли в концентрированной муравьинойкислоте, высушивали в вакуумном испарителе и денатурировали кипячением вбуфере с 2% SDS.
Далее пробы обессоливали, расщепляли на пептиды с помощьютрипсина, пептиды разделяли на колонке HPLC и идентифицировали с помощью134масс-спектрометрии (см. главу “Материалы и методы»). Такой подход лишѐннедостатков, которые возникают при использовании двумерного электрофореза.Крометого,отсутствиеэтапавыделениябелкаизгеляповышаетчувствительность метода. Необходимость использования муравьиной кислотысвязана с тем, что фибриллы некоторых амилоидных белков не растворимы дажепри кипячении в буфере с SDS.В таблице 17 представлены белки, идентифицированные с помощью новоймодификации нашего метода в штамме GT81-1C [PSI+][PIN+] и его изогенномдеривате GT409 [psi-][pin-]. Данный подход позволяет идентифицировать белки,представленные в пробах даже в следовых количествах.
В таблице 17представлены лишь первые 30 белков, идентифицированных в штамме GT81-1C[PSI+][PIN+] с самым высоким счѐтом. Из таблицы исключены данныеидентификации белков большой и малой субъединиц рибосомы, которые быливыявлены в обоих штаммах (результаты не представлены). Для всех этихрибосомных белков характерна экстремально щелочная изоэлектрическая точка(pI ≥ 10), что препятствовало их выявлению при использовании двумерногоэлектрофореза (см. рис. 19А и 19Б). По всей вероятности, субъединицыдрожжевой рибосомы представляют собой прочный РНП-комплекс, который неполностью распадается на отдельные белки в результате обработки РНК-азой А и1% SDS при комнатной температуре.В штамме [PSI+][PIN+], но не в его изогенном деривате [psi-][pin-], былиидентифицированы белки Sup35 и Rnq1 - детерминанты прионных факторов[PSI+] и [PIN+], соответственнo, а также белки Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1.
Известно,что шапероны Sis1, Ssb1, Ssb2 и Ssa1 взаимодействуют с прионными агрегатамибелка Sup35 и играют роль в поддержании этого приона [Newnam et al., 1999;Chernoff et al., 1999; Sondheimer et al., 2001; Higurashi et al., 2008]. Исходя из этихданных, выявление перечисленных шаперонов методом PSIA объясняется ихфизическим взаимодействием с прионом [PSI+].135Разработанный нами метод впервые позволил оценить возможностьприсутствия в клетках прионов, не имеющих фенотипического проявления. Повсей вероятности, прионизация является редким событием – в штаммах[PSI+][PIN+] идентифицированы белки Sup35 и Rnq1, но, помимо шаперонов, невыявлено других белков, по которым различаются фракции SDS-устойчивыхагрегатов тестируемых штаммов.Модификация метода PSIA HPLC-MALDI впервые позволила на основанииданных протеомного анализа составить список перспективных кандидатов нароль функциональных дрожжевых амилоидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
