Диссертация (1144700), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Плазмида pASB2, содержащая ген SUP35 под контролем собственногопромотора.На фоне продукции белка Sup35 P. methanolica, для штамма 3-4-1-1-D931[NSI+] характерна нонсенс-супрессия (рис. 13А), которая элиминируется на средес GuHCl. По всей вероятности, этот белок, как и Aβ-Sup35MC, недостаточноэффективно выполняет функцию фактора терминации трансляции, а фактор[NSI+] является провокационным фоном, позволяющим выявлять снижениеэффективности терминации трансляции на фенотипическом уровне.Штамм [NSI+], содержащий плазмиду pNR-ΔABF1, демонстрирует сильныйрост на среде без аденина (рис. 13А). После пассирования клеток на среде сGuHCl интенсивность роста на среде без аденина заметно снижается.
С помощьюПЦР в реальном времени мы показали, что уровень экспрессии гена SUP35 вштамме, содержащем плазмиду pNR-ΔABF1 с мутацией в промоторе SUP35,достоверно ниже (p ≤ 0.01), чем в штамме, несущем плазмиду pASB2 (рис 13Б).Рисунок 13. А- Анализ нонсенс-супрессии в дериватах штамма [NSI+], в которыхгибридный ген Aβ-SUP35MC замещѐн на: 1) ген SUP35 P.methanolica (pFL38SUP35P); 2) ген SUP35 S.
cerevisiae с делецией локуса ABF в промоторнойобласти; 3) интактный ген SUP35 S. cerevisiae. Б - сравнение количества мРНКSUP35 в штаммах [nsi–], несущих плазмиды pASB2 и pNRΔABF1. Данныепредставлены как ΔСt ± стандартное отклонение.109Значение параметров ΔСt (см.
«Материалы и методы») соответствует 2.12 ± 0.431для pASB2 и –0.59 ± 0.381 для pNRΔABF1 (рис. 13Б). Таким образом, уровеньэкспрессии гена SUP35 в штамме с плазмидой pNRΔABF1 примерно в шесть разниже, чем в штамме, несущем плазмиду pASB2. Полученные данныесвидетельствуютотом,чтосупрессия,опосредованная[NSI+],можетнаблюдаться как на фоне аминокислотных замен в белке, выполняющем рольфактора eRF3, так и при снижении уровня экспрессии соответствующего гена.Рисунок 14. Сравнительный анализ частот считывания стоп-кодонов UGA и UAGкак значащих в штаммах [NSI+] и [nsi-].Нонсенс-супрессия, опосредованная фактором [NSI+], может являтьсяследствием снижения эффективности терминации трансляции, или вызыватьсяиными причинами – например, изменением регуляции биохимического путидеградации нонсенс-содержащих мРНК. Для выяснения возможной взаимосвязипроявления [NSI+] с регуляцией терминации трансляции изогенные штаммы 2-11-D931 [NSI+] и 1-2-1-1-D931 [nsi-] были трансформированы плазмидами pDB691или pDB721, в составе которых два гена, кодирующих две различныелюциферазы,разделеныстоп-кодонамиUGAиUAG,соответственно.110Исследуемые штаммы трансформировали также плазмидами pDB690 илиpDB720, в которых на месте стоп-кодонов расположены значащие триплеты.Показатель, отражающий сравнительную активность двух люцифераз вштаммах [NSI+] и [nsi-], вычисляли как указано в разделе «Материалы и методы».Полученные данные показали, что [NSI+] вызывает статистически достоверноеувеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG как значащих (рис.14).Такимобразом,детерминант[NSI+]вызываетснижениеэффективноститерминации трансляции, и этот эффект может проявляться в виде омнипотентнойнонсенс-супрессии на фоне мутаций в гене SUP35, не имеющих собственногопроявления.3.1.4.
Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+][NSI+], как и большинство дрожжевых прионов, эффективно элиминируетсяпри пассировании клеток на среде с GuHCl. Эти данные позволили предположить,что фактор [NSI+] имеет прионную природу. GuHCl -зависимая элиминациядрожжевых прионов связана с тем, что это вещество ингибирует АТФ-азнуюактивность шаперона Hsp104 [Ferreira et al., 2001], который необходим длярасщепления (т.е. размножения) прионных агрегатов. Мы оценили влияниеделеции и сверхэкспрессии HSP104 на передачу фактора [NSI+] в ряду клеточныхпоколений. Все клоны штамма 3-1-1-D931 (дериват 1-1-D931 [NSI+]) с делециейHSP104)утратилисупрессорныйфенотип(рис.15).Известно,чтосверхэкспрессия HSP104 вызывает элиминацию [PSI+][Chernoff et al., 1995], но невлияет на поддержание всех остальных дрожжевых прионов.
Штамм 1-1-D931[NSI+] трансформировали многокопийной плазмидой pLH105, содержащей генHSP104 под контролем собственного промотора. Трансформантов отбирали населективной среде без лейцина, трижды переносили методом «отпечатков» натакую же среду и затем перепечатывали на среду без аденина. Как показано на111рисунке 15, сверхэкспрессия HSP104 не вызывает элиминацию супрессорногофенотипа в штамме [NSI+] (рис. 15).Рисунок 15. Влияние делеции и сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание ипроявление фактора [NSI+]. Дрожжи фотографировали на третий день роста насреде без аденина.Поскольку у дрожжей прионизация вызывает наследуемое изменение формыбелка, прионные факторы обладают общими характеристиками [по: Wickner et al.,1999] с изменениями:1.
могут возникать de novo после элиминации;2. наследуются как нехромосомные доминантные факторы;3. демонстрируют инфекционность (передаются цитодукцией и в результатебелковой трансформации);4. наследование большинства дрожжевых прионов зависит от продукциишаперона Hsp104.Фактор [NSI+] демонстрирует сходство с дрожжевыми прионами – онэлиминируется при пассировании на среде с GuHCl и для его поддержаниятребуется продукция шаперона Hsp104. Мы проверили соответствие фактора[NSI+] всем остальным характеристикам дрожжевых прионов.112Фактор [NSI+] исходно был выявлен в штамме 1-1-D931, который содержитприон [PIN+] (прионная форма белка Rnq1).
Прион [PIN+] является затравкой,необходимой для возникновения другого приона [PSI+], а также для агрегациинекоторых амилоидных белков [Derkatch et al., 1997; Vitrenko et al., 2007; Du andLi 2014]. С учѐтом этих фактов, мы оценивали частоты спонтанноговозникновения [NSI+] в изогенных штаммах 1-4-1-1-D931 [pin-] и 2-4-1-1D931[PIN+]. Штамм 1-4-1-1-D931 был получен за счѐт пассирования клеток 4-1-1-D931[NSI+] на среде с GuHCl. Для получения штамма 2-4-1-1D931, содержащегофактор [PIN+], сферопласты штамма 1-4-1-1-D931 [pin-] трансформировалибелковым экстрактом из штамма BY4742 [PIN+] и плазмидой pmCUPNMsGFP,продуцирующей белок Sup35NM-GFP.
Для дальнейшей работы с помощьюфлуоресцентной микроскопии отбирали трансформантов, содержащих агрегатыбелка Sup35NM-GFP, которые выявляются лишь в клетках, имеющих фактор[PIN+]. Возникновение отдельных клонов, демонстрирующих фенотип [NSI+](рост на среде без аденина, который элиминируется пассированием клеток насреде с GuHCl), было отмечено с частотой 5 x 10-6 лишь в штамме 2-4-1-1D931[PIN+], но не в изогенном ему штамме 1-4-1-1-D931 [pin-] (табл. 9).Таблица 9.
Спонтанное возникновение de novo фактора [NSI+]Количество клонов Ade+ШтаммКол-воклетокНеСтабильные в митозестабильныеНе лечатся лечатсяв митозеGuHClGuHCl([NSI+])Всего2-4-1-1D9312x10421088[nsi-][PIN+]2x10571232x106253081131-4-1-1D9312x104020[nsi-][pin-]2x10541402x1061135066На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+]способен возникать повторно после элиминации. Мы не можем сделать вывод овозможном влиянии приона [PIN+] на спонтанное возникновение фактора [NSI+],поскольку различия не являются статистически достоверными.Для анализа характера наследования фактора [NSI+] штамм 1-1-D931[NSI+] aтипа спаривания, содержащий плазмиду pU-Aβ-Sup35MC, скрещивали сизогенным ему штаммом 2-1-1-1-D931 [nsi-] α-типа спаривания, содержащимплазмиду pL-Aβ-Sup35MC.
Диплоидов отбирали на среде –Leu-Ura.Диплоидный статус отдельных клонов проверяли контрольным скрещиваниемс тестерами типа спаривания. Все отобранные диплоиды демонстрировалинонсенс-супрессорный фенотип, изгоняемый при трѐхкратном пассированииклеток на среде с 5mM GuHCl (рис. 16). Таким образом, [NSI+] демонстрируетдоминантное проявление.114Рисунок 16. Рост на среде без аденина диплоидных штаммов, полученных врезультате скрещивания гаплоидов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-], до и послепассирования на среде с GuHCl.При споруляции диплоидных клонов в тетрадах выявлялось лишь от одной дотрѐх жизнеспособных аскоспор.
В связи с этим наследование фактора [NSI+] умейотических сегрегантов анализировали с помощью случайной выборкиаскоспор.Вподавляющеепотомствевсехбольшинствопроанализированныхгаплоидныхдиплоидныхсегрегантов(237клоновклонов)демонстрировали супрессорный фенотип (Ade+) и лишь 9 клонов не росли насреде без аденина (табл. 10).Таблица 10. Фенотип гаплоидных сегрегантов диплоидных клонов, полученных врезультате скрещивания штаммов 1-1-D931[NSI+] и 2-2-1-1-D931[nsi-]№Кол-воКол-воРасщеплениедиплоидного гаплоидныхгаплоидныхпо полуклонасегрегантовсегрегантов115Ade+Ade–127315 a: 15 229014 a: 15 329218 a: 13 427211 a: 18 631117 a: 15 732116 a: 17 829017 a: 12 933019 a: 14 Всего:2379127 а: 119αКлоны утрачивали способность к росту на среде без аденина послепассирования на среде с GuHCl (результаты не представлены).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
