Диссертация (1144700), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Вкачестве матрицы для амплификации гена GAS1 использовали геномную ДНК,выделенную из штамма BY4742.Для проведения геномных скринингов в работе использовали адреснуюдрожжевую геномную библиотеку YSC4613 “Open Biosystems” (ЕС). Библиотекавключает 1588 клонов E.
coli, несущих челночный многокопийный вектор pGP564с уникальными фрагментами генома S. cerevisiae, клонированными в вектор посайтам гидролиза BamHI. Вставки содержат несколько открытых рамоксчитывания. Каждый клон содержит одну плазмиду с несколькими генами S.cerevisiae с известной нуклеотидной последовательностью. Вектор pGP564маркирован геном устойчивости к антибиотику канамицину для селекции вбактериях и геном прототрофности по лейцину для селекции в дрожжах.Таблица 5 Плазмиды, использованные в работеПлазмидаТип/ПромоторБелокСсылкаSUP35Sup35 P.m.Derkatch, et al.маркерpFL38-SUP35PCEN/URA3P.m.pRS3152000CEN/LEU2Sikorski andHieter, 1989pFL44S2µ /URA3American TypeCulture CollectionpRS316CGCEN/URA3PCUP1GFPLiu andLindquist, 199982Продолжение таблицы 5pRS315-CEN/LEU2PSUP35Sup35MСSUP35MCpRS316-Saifitdinova etal., 2010CEN/URA3PSUP35Sup35MСSUP35MCSaifitdinova etal., 2010pmCUPNMsGFP 2µ /URA3PCUP1Sup35NM-Serio et al.
1999GFPpSP-YFPCEN/URA3PCUP1Sup35SP-YFPRubel et al.,2013pSP-CFPCEN/URA3PCUP1Sup35SP-CFPRubel et al.,2013pmCUP1-2µ/LEU2PCUP1Sup35MСSUP35MCPCUP1-al., 20102µ /URA3PCUP1GFPGFP(URA3)pRS315-SUP45Saifitdinova etРубель и др.2008CEN/LEU2PSUP45Sup45Moskalenko etal. 2003pYCH-U2CEN/URA3PSUP35Sup35Derkatch et al.1997pASB2CEN/LEU2PSUP35Sup35Nizhnikov et al.,2012PGPD-2µ /URA3PGPDGFPGFP(URA3)PGPDGFP(LEU2)Рубель и др.20082µ / LEU2PGPDGFPRubel et al.,201383Продолжение таблицы 5pL-Aβ-CEN/LEU2PCUP1Aβ-Sup35MCSup35MCpU-Aβ-al.
2010CEN/URA3PCUP1Aβ-Sup35MCЦапонина идр. 2005Sup35MCYEpHOSaifitdinova et2µ / LEU2PHOHoJensen et al.,1983pDB690CEN/URA3PPGK(CGAC),pDB691CEN/URA3PPGK(UGAC),pDB720CEN/URA3PPGK(UAGC)pDB721CEN/URA3PPGK(CAGC)pLH1052µ /LEU2PGPD1LucR-CGAC-Keeling et al.LucF2004LucR-UGAC-Keeling et al.LucF2004LucR-UAGC-Keeling et al.LucF2004LucR-CAGC-Keeling et al.LucF2004Hsp104Vogel et al.,1995PGPD1-GAS1-2µ / URA3PGPD1Gas1CEN/LEU2PRnq1Rnq1YFPpID130Kadnar et al.,2010p426GPD–2µ /URA3PGPD1Swi1SWI1YFPpCUP1-RNQ1-Du and Li,20142μ/LEU2PCUP1Rnq1-CFP2μ/URA3PGPD1Aβ-GFPCFP(LEU2)PGPD-AβGFP(URA3)Rubel et al.,201384Продолжение таблицы 5pGPD-Aβ-2μ/LEU2PGPD1Aβ-YFPYFP(URA3)pGPD-PrP23-231-20132μ/URA3PGPD1PrP23-231-GFPGFP(URA3)pGPD-PrP23-231-2μ/LEU2PGPD1PrP23-231-YFP2μ/LEU2PGPD1PrP23-231-CFP2μ/LEU2PGPD1PrP28-231-CFP2μ/LEU2PGPD1PrP90-231-CFP2μ/URA3PGPD1PrP90-231-CFP2μ/LEU2PGPD1PrP110-231-CFP2μ/URA3PGPD1YFP2μ/LEU2PGPD1YFPRubel et al.,20132μ/LEU2PGPD1CFPCFP(LEU2)pGPD-Rubel et al.,2013YFP(LEU2)pGPD-Rubel et al.,2013YFP(URA3)pGPD-Rubel et al.,2013CFP(LEU2)pGPD-Rubel et al.,2013GFP(URA3)pGPD-PrP110-231-Rubel et al.,2013CFP(LEU2)PGPD-PrP90-231-Rubel et al.,2013CFP(LEU2)pGPD-PrP90-231-Rubel et al.,2013CFP(LEU2)pGPD-PrP28-231-Rubel et al.,2013YFP(URA3)pGPD-PrP23-231-Rubel et al.,Rubel et al.,20132μ/URA3PGPD1CFPCFP(URA3)PMIT1-MIT1-GFP CEN/URA3Rubel et al.,2013PMIT1Mit185Продолжение таблицы 52µ /URA3pU-VTS1PCUP1Vts1Nizhnikov et al.,2012pNR-ΔABFCEN/LEU2PSUP35Abf1Нижников идр., 2013Примечание.
CEN – центромерная плазмида, 2µ- многокопийная плазмида. Всеплазмиды в таблице содержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в E.coli.Таблица 6. Праймеры, использованные для плазмидного конструированияПраймерПоследовательность 5'-3'FPrP23CCCGGATCCTATATGTCTAAAAAGCGGCCAAAGCCTGGAGGGTFPrP28GACTTTGGATCCTATATGCCTGGAGGGTGGAACACFPrP90GTTCATGGATCCTATATGTCTCAAGGAGGGGGTACCCATFPrP110GAATAGGATCCACAATGCATATGGCAGGGGCTGCGFAβGGGTCCACGGATCCTATATGTCTGATGCAGAATTCCGACATRAβGTTATAAAGGATCCGACAACACCGCCCACCATRPrP231CATCCGCGGGCTGGATCTTCTCCCGTCGTAATAGGCCTFAβGGGTCCACGGATCCTATATGTCTGATGCAGAATTCCGACATRAβGTTATAAAGGATCCGACAACACCGCCCACCATFVTS1GAGCGGATCCATGAAACATCCGTATGAGGAATTCCRVTS1CATCCCGCGGTGCAACGTCAAGACAATCAACFMIT1CCGATCGATGCTTCGATTGGTAACAGTGRMIT1CGCCCGCGGTTGTGTAGTAGTTGAAGTGTTFGAS1GACTTAGGATCCTATATGTTGTTTAAATCCCTTTCARGAS1CAAATACCGCGGTCCGGAACCCAAATCAACA862.3.Методы дрожжевой генетикиВ работе применяли стандартные генетические методы, используемые приработе с дрожжами: метод рассева истощающим штрихом, метод селективныхсред для анализа ауксотрофности штаммов, метод отпечатков, методы тетрадногоанализа и случайной выборки аскоспор [Инге-Вечтомов, 1971, Захаров и др., 1984;Rose et al., 1990].
Тип спаривания исследуемых штаммов определяли поспособности образовывать гибриды с тестерными штаммами. Для элиминацииприоноподобных детерминантов штаммы пассировали 3 раза на среде YAPD,содержащей хлорид гуанидина (GuHCl). Затем дрожжи клонировали на средеYAPD и перепечатывали на среду без аденина [Tuite et al., 1981]. Отбираликлоны, утратившие способность к росту на среде без аденина. Супрессиюмутаций ade1-14 (UGA) trp1-289 (UAG) оценивали по способности к ростуштаммов на селективных средах без аденина и без триптофана, соответственно.Потерю плазмид, содержащих маркер URA3, производили на селективной среде сдобавлением 5-FOA [Kaiser et al., 1994]. Селекцию клонов, устойчивых кгенетицину, проводили путем трехкратного пассирования на твердой среде YAPDс добавлением G418 [Sambrook et al.
1989]. Анализ роста штаммов на среде MG иMGly проводили путем трех последовательных перепечатываний штаммов синкубацией после каждого перепечатывания в течение суток при 300С. Тетрадныйанализ проводили под микроскопом производства “Carl Zeiss” (Германия),используя микроманипулятор Ergaval Series 10 “Carl Zeiss” (Германия).Для изучения возможности переноса цитоплазматических детерминантовпутѐм цитодукции использовали систему отбора цитодуктантов, основанную натом, что донором цитоплазмы является штамм [rho+], а реципиентом – штамм[rho0] (полная делеция митохондриальной ДНК), маркированный рецессивноймутациейустойчивостикпрепятствующей кариогамии.циклогексимиду(cyhr)имутациейkar1-1,87Трансформацию дрожжей плазмидной ДНК проводили по стандартнойметодике с использованием ацетата лития [Rose et al., 1990]. Для повышенияэффективности трансформации в каждую пробу добавляли по 6 мкг ДНКносителя (обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, “Fermentas” (Литва)).Получение компетентных клеток E.
coli и трансформацию бактерий проводили постандартной методике [Inoue et al., 1990].Белковую трансформацию для передачи прионных факторов из клетокодного штамма в другой проводили согласно методике, описанной ранее [Tanakaand Weissman 2006; Patel and Liebman 2007].
Для отбора трансформантов,получивших прион [PIN+], сферопласты [pin-] трансформировали белковымлизатом из штамма [pin-], а также плазмидой pmCUPNMsGFP, продуцирующейхимерный белок Sup35NM-GFP. Отбирали трансформантов, в которых белокSup35NM-GFPформировалцитологическидетектируемыеагрегаты,чтохарактерно для штаммов [PIN+]. В остальных случаях о передаче прионов судилипофенотипическимизменениямисследуемыхштаммовиподаннымбиохимического анализа, позволяющего выявлять прионные агрегаты.2.4.Полимеразная цепная реакция в реальном времениТотальнуюиспользованиемРНКвыделялиреагента“Trizol”изисследуемых(“Invitrogene”,штаммовСША)подрожжейспротоколупроизводителя.
Для исключения возможности контаминации ДНК, выделеннуютотальную РНК обрабатывали ДНК-зой I (“Fermentas”). Реакцию обратнойтранскрипции проводили с использованием набора Super Script III (“Invitrogene”,США) согласно протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию вреальном времени (ПЦРРВ) проводили в амплификаторе АНК-16 (ИАнП РАН).Последовательности праймеров и зондов TaqMan приведены в таблице 7. Анализнезависимо выделенных проб тотальной мРНК проводили при помощи метода 2 Ct, предложенного Ливаком и Шмитгеном [Livak and Schmittgen, 2001]. В88данном методе используется параметр Ct, который показывает различия винтенсивности сигналов между исследуемым и контрольным (ACT1) генами.Затем, рассчитывают параметр Ct, который равен разности между параметрамиCt в эксперименте и контроле.
В заключение рассчитывается 2-C(t). Этозначение соответствует разнице в количестве мРНК между экспериментальной иконтрольной пробой. Результаты представлены с планками погрешностей,соответствующими стандартному отклонению. Достоверность отличий оценивалипри помощи непараметрического критерия Манна-Уитни с использованиемпрограммного обеспечения “Statistica” версии 6.0 (“StatSoft”).Таблица 7.
Праймеры и зонды для ПЦРРВНазваниеПоследовательность 5’-3’ACT1probe(FAM*)CGTGCTGTCTTCCCATCTATCGTCGGT(BHQ1**)ACT1fTAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGACT1rTCATCACCAACGTAGGAGTCTTSUP35probeF (R6G***)CACCCTACTGATGCCTAACAAAACCGCT(BHQ1)RTSUP35RGTTTAACTTGCTCACCACACATARTSUP35FTATTGCCGCTAAGATGAAGGATПримечания:* (FAM) – флуорофор FAM.** (BHQ1) – гаситель флуоресценции BHQ1.*** (R6G) – флуорофор R6G.2.5.Метод бицистронной люминесценцииЭффективность терминации трансляции оценивали с помощью методабицистронной люминесценции [по: Valouev et al., 2009].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
