Диссертация (1144700), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Сверхэкспрессия генаHSP104 не влияет на стабильность фактора [SWI+].1.4.2.5.Факторы [ISP+], [MOT3+], [OCT+] и [MOD+]Целенаправленныйпоискприоновиисследованиефакторов,предположительно имеющих прионную природу, привели к открытию в началеXXI века ряда новых белков дрожжей S. cerevisiae, способных к прионномупревращению.
Фактор [ISP+] снижает эффективность нонсенс-супрессии умутантов по гену SUP35. Этот фактор проявляет нехромосомный характернаследования, обратимо изгоняется при инкубации на среде с GuHCl идемонстрирует доминантное наследование при скрещивании штаммов [ISP+] соштаммами [isp-]. Отсутствие шаперона Hsp104, так же как и его сверхпродукция,не влияет на проявление и поддержание [ISP+] [Рогоза и др., 2009].
Структурныйген фактора [ISP+] - SFP1 кодирует транскрипционный фактор, регулирующийэкспрессию рибосомных генов [Marion et al., 2004; Xu and Norris, 1998; Cipollinaet al., 2005]. Сверхэкспрессия гена SFP1 индуцирует появление [ISP+], делециягена SFP1 приводит к потере этого фактора [Рогоза и др., 2009; Rogoza et al.,2010].Фактор [MOT3+] обнаружен в результате направленного скрининга прионовсреди дрожжевых белков, содержащих Q/N-обогащѐнные последовательности[Alberti et al., 2009]. Белок Mot3p - это транскрипционный регулятор,участвующий в контроле метаболизма углерода и стресс-ответа [Grishin et al.,511998].
В аэробных условиях он подавляет экспрессию генов, отвечающих за роств анаэробных условиях. Прионный домен белка Mot3, слитый с желтымфлуоресцирующим белком EYFP, образует видимые агрегаты в штаммах[MOT3+]. Прионный домен белка Mot3 образует in vitro амилоидные агрегаты,устойчивые к 2% SDS. Фактор [MOT3+] наследуется доминантно, изгоняется приинкубации на среде с GuHCl, его стабильность зависит от шаперона Hsp104[Alberti et al., 2009].Фактор [OСT+] – прионная форма белка Cyc8, входящего в составтранскрипционного регуляторного комплекса Cyc8-Tup1, контролирующегоэкспрессию более 7% генов дрожжей S. cerevisiae.
Cyc8 был выявлен в скринингебелков, сверхпродукция которых повышает частоту возникновения фактора [PSI+]de novo. Сверхпродукция прионного С-терминального домена белка Cyc8приводит к появлению фактора [OСT+]. Фактор [OСT+] наследуется доминантно,передается при цитодукции, изгоняется при инкубации на среде с GuHCl и врезультате инактивации белка Hsp104.
Сверхэкспрессия гена HSP104 не влияет настабильность фактора [OСT+]. В клетках [OСT+] химерный белок Cyc8-YFPобразует агрегаты как в цитоплазме, так и в ядре [Patel et al., 2009].Фактор [MOD+] представляет собой прионную форму белка Mod5 [Suzuki etal., 2012]. Mod5 в отличие от всех прочих дрожжевых белков, формирующихамилоидные агрегаты, не содержит Q/N-обогащѐнных последовательностей.СверхпродукцияMod5,атакжетрансформациядрожжейамилоиднымифибриллами этого белка, вызывает индукцию фактора [MOD+] [Suzuki et al.,2012].
Делеция Hsp104 или пассирование штамма [MOD+] на среде с GuHClвызывают элиминацию прионного детерминанта. Интересно отметить, что врезультате прионизации Mod5 в дрожжевой клетке повышается уровеньэргостерола, что способствует большей устойчивости культуры к антигрибковымагентам, таким как флюконазол и кетоконазол [Suzuki et al., 2012].521.4.2.6.Факторы [] и [GAR+]Определение Стенли Прусинера, согласно которому прионы представляютсобой инфекционные белковые частицы [Prusiner, 1989], не постулирует, чтобелок обязательно должен изменять конформацию. В соответствии с этим,формированиеагрегатовсамовоспроизводящихсянельзяприоногенеза.рассматриватьРобертсикакВикнер(расщепляющихся)единственноописалиамилоидныхвозможныймеханизмальтернативныймеханизмсамовоспроизводящихся изменений белка, приводящих к наследственнымизменениям [Roberts and Wickner, 2003].
Активация вакуолярной протеазы В(PrB) происходит в результате нескольких последовательных этапов процессинга.Процессинг регулируется протеазой А (PrA), а также автокаталитически за счѐтактивности зрелого белка PrB. Активная форма PrB осуществляет протеолизбелков. В частности, белки PrA и PrB совместно регулируют процессинг ещѐодной протеазы CpY, и их инактивация блокирует споруляцию. Было показано,что при пассировании дрожжей на среде с галактозой делеция гена PEP4,кодирующего PrA, не приводит к инактивации PrB, то есть в этих условияхпроцессинг PrB может осуществляться автокаталитически. Пересев клеток Δpep4на среду с глюкозой приводит к необратимой элиминации активности PrB.Активная форма белка PrB передаѐтся цитодукцией, если в качестве донораиспользуется штамм Δpep4, пассирующийся на среде с галактозой, а в качествереципиента такой же штамм, в котором PrB инактивирован пассированием насреде с глюкозой.
Таким образом, активная форма PrB, как и прионы,поддерживается автокаталитически и обладает инфекционностью (передаѐтсяцитодукцией).Исходяизэтихданных,авторыпредложилиназыватьпроцессированный белок PrB прионом [] [Roberts and Wickner, 2003]. По сути, вэтой работе был описан новый механизм белковой наследственности, которыйпринципиальноамилоидов.отличаетсяотмеханизманаследованияинфекционных53Другим примером неамилоидных прионов является фактор [GAR+]. В норме,при наличии в среде глюкозы, в дрожжевой клетке происходит репрессияпотребления других источников углерода. Фактор [GAR+] блокирует глюкознуюрепрессию, штаммы [GAR+] способны потреблять глицерин в присутствиеглюкозамина [Ball et al.
1976]. Фактор [GAR+], как и прочие прионы, доминантен,наследуется 4:0 в мейозе, передаѐтся цитодукцией, и может возникать de novo.Исследованию данного фактора посвящѐн ряд работ, но по-прежнему нет ясностив вопросе о его детерминантах. Индукция [GAR+] происходит с высокой частотойпри сверхэкспрессии гена STD1, а к его элиминации приводит одновременнаяделеция гена STD1 и N-терминальной части гена PMA1 [Brown and Lindquist,2009]. Белки Pma1 и Std1 не образуют амилоидные полимеры в штаммах [GAR+][Brown and Lindquist, 2009].
Косвенным свидетельством в пользу неамилоиднойприроды [GAR+] является его независимость от активности шаперона Hsp104[Brown and Lindquist, 2009]. Возможно, возникновение фактора [GAR+], не связанос конформационными изменениями белка, а является примером структурнойнаследственности, сходным с кортикальной наследственностью у инфузорий[Beisson and Sonneborn, 1965]. Можно допустить, что наличие или отсутствиефактора [GAR+] определяется разными способами сборки белкового комплекса,состоящего из двух или нескольких элементов. Мы можем предложить и другуювозможную модель – временная сверхпродукция белка Std1, который являетсяактиватором киназ [Kuchin et al., 2003], вызывает гипперфосфорилирование Pma1,и однажды распознав этот белок в качестве мишени, киназы продолжаютобеспечивать фосфорилирование Pma1 в ряду поколений.
Наша гипотеза имеетправо на жизнь, поскольку последовательность Pma1 содержит необычайно много(а именно 28) потенциальных сайтов фосфорилирования [Swaney et al., 2013].1.4.2.7.Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserinaФактор [Het-s] это ещѐ один пример эпигенетического изменения,обусловленного прионной конверсией. Слияние гиф грибов, принадлежащих к54двум разным мицелиям, приводит к образованию гетерокариона, однако в рядеслучаев этот процесс заканчивается гибелью гетерокариона из-за отличий междудвумя мицелиями по аллелям генов несовместимости (рисунок 7).
У грибааскомицета Podospora anserina известно 9 локусов het (от heterokaryon formation),контролирующих вегетативную несовместимость. Один из них - локус het-sпредставлен двумя аллелями (het-s и het-S). Прион образует только белковыйпродукт аллели het-s [Coustou et al., 1997]. В штаммах [Het-s*] белок HET-sнаходится в нативной конформации. Если происходит прионизация белка, тофенотип штамма обозначают как [Het-s].
При слиянии прионсодержащих гиф([Het-s]) и гиф [Het-s*], в которых белок представлен в мономерной изоформе,образуется гетерокарион и весь пул белка HET-s переходит в прионное состояние.При слиянии прионсодержащих гиф ([Het-s]) и гиф, содержащих аллель het-S,происходитгибельгетерокариона.Такимобразом,прионконтролируетвегетативную несовместимость [Coustou et al., 1997; Wickner, 1997].Белок HET-s отличается от большинства известных прионных белковнизших эукариот отсутствием участков с повышенным содержанием глутамина иаспарагина.
В ходе изучения трехмерной структуры белка HET-s границы ифункциидоменовбылиопределеныследующимобразом:N-домен(аминокислоты 1-217), образованный в основном α-спиралями, важен длярегуляциинесовместимости,тогдакакнеструктурированныйС-домен(аминокислоты 218-289) отвечает за прионизацию [Balguerie et al., 2003]. Послеперехода в прионную конформацию в С-домене преобладают β-слои, образующиеструктуру устойчивую к обработке протеиназой К [Balguerie et al., 2004].Изучение фибрилл, полученных in vitro, показало, что HET-s(218-289) образуетлевозакрученный β-соленоид с треугольным гидрофобным основанием [Wasmer etal., 2008].
Для фибрилл HET-s(218-289) характерна полярность, и добавлениеновых мономеров в условиях in vitro при комнатной температуре происходиттолько с одного конца. Механизм добавления мономера к уже имеющемусяамилоиду включает в себя присоединение неструктурированного прионногодомена к концу протофибриллы с последующим конформационным изменением и55встраиванием в структуру фибриллы. [Baiesi et al., 2011]. Белок HET-s (218-289)способен прионизоваться и при экспрессии его структурного гена в клеткахдрожжей S.cerevisiae. В этом случае поддержание прионной конформации требуетналичия белка-шаперона Hsp104 [Taneja et al., 2007].Рисунок 7.
Система несовместимости [Het-s]/[Het-S] [по: Saupe, 2011].Гетерокарион, образующийся в результате слияния мицелиев [Het-s] и [Het-S](обозначен серым цветом), погибает.1.4.3. Функциональная значимость прионовВ последние годы разгорелась дискуссия о функциональной значимостиприонов микроорганизмов, причѐм наиболее активно обсуждаются две гипотезы,абсолютно противоречащие друг другу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
