Диссертация (1144700), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Белок Ure2 участвует в регуляциикатаболизма азота и функционирует в клетке в виде димера. При росте клеток насредах с богатыми источниками азота белок Ure2 блокирует активность белкаGln3 - позитивного регулятора транскрипции гена DAL5, продукт которогообеспечивает транспорт уреидосукцината в клетку [Mitchell and Magasanik, 1984].Мутации в гене URE2, как и наличие фактора [URE3], приводят к дерепрессииDal5, в результате чего клетки приобретают способность использоватьуреидосукцинат в качестве источника азота и предшественника урацила [Drillienet al., 1973].
Таким образом, штаммы, ауксотрофные по урацилу и содержащиефактор [URE3], приобретают способность расти на среде без урацила.Показано, что пассирование дрожжей на среде с 5мМ GuHCl приводит кпотере приона [URE3]. Элиминация приона обратима – частота спонтанноговозникновения de novo составляет примерно 10-6. Временная сверхпродукциябелка Ure2 увеличивает частоту возникновения [URE3] примерно в 100 раз.45Фенотип [URE3] сходен с фенотипическим проявлением мутаций в гене URE2, адля воспроизведения приона [URE3] необходимо наличие интактного гена URE2[по: Wickner, 1994; Wickner et al., 2004].Белок Ure2 дрожжей состоит из 354 аминокислотных остатков и его можноразделить на N- и С-терминальные домены [Fernandez-Bellot et al., 1999].
Cтерминальный домен репрессирует транскрипцию гена DAL5, тогда как Nтерминальная часть Ure2 (аминокислоты 1-65) необходима и достаточна дляиндукции и поддержания приона [URE3] [Masison and Wickner, 1995]. Nтерминальный домен Ure2 обладает способностью образовывать агрегаты,имеющие -складчатую структуру [Taylor et al., 1999].
Следует отметить, что Nдомен Ure2 обогащен аспарагиновыми остатками (их содержание составляетоколо 40%). Аспарагин-богатаяобласть продолжаетсявплоть до 80-гоаминокислотного остатка. Последовательность, ответственная за прионизациюUre2, консервативна, аминокислоты с 10 по 39 идентичны у дрожжей S.cerevisiae,Ashbya gossypii, Candida kefyr, Candida glabrata, Candida lactis [Edskes andWickner et al., 2002].Химерный белок Ure2-GFP образует агрегаты в штаммах [URE3], но этогобелка приводит к потере приона. Это, возможно, связано с тем, чтоприсоединение химерного белка, включающего последовательность GFP, кпротофибриллам Ure2 препятствует дальнейшей полимеризации. В клетках[URE3] что белок Ure2 образует глобулярные структуры из филаментозныхполимеров [Speransky et al., 2001], причем эти структуры устойчивы к кипячениюи для их разрушения необходима дополнительная обработка мочевиной.
БелокUre2 также может образовывать амилоидные структуры in vitro, сходные сфибриллами прионных белков млекопитающих [Taylor et al., 1999; Thual et al.,1999].Стабильность фактора [URE3] зависит от наличия в клетке белковшаперонов Hsp104 и Ydj1 (Hsp40). При этом сверхэкспрессия гена HSP104 неизгоняет прион, тогда как сверхэкспрессия YDJ1 приводит к его элиминации.46Штаммы с делецией гена HSP104 не могут поддерживать [URE3] [Moriyama et al.,2000]. На поддержание [URE3] влияют также мутации в гене SSA2, кодирующемшаперон семейства Hsp70. Показано, что белки Ure2 из дрожжей S.
paradoxus и S.uvarum также способны прионизоваться в дрожжах S. cerevisiae, при этомвозможна передача прионной конформации между белками из дрожжей разныхвидов [Baudin-Baillieu et al., 2003; Crapeau et al., 2009].1.4.2.2.Фактор [PSI+][PSI+] является доминантным омнипотентным нонсенс-супрессором илиаллосупрессором, то есть его появление в клетке дрожжей способствуетсчитыванию всех трех кодонов-нонсенсов как значащих [Cox, 1965; Liebman andSherman, 1979]. Гипотеза о прионной природе фактора [PSI+] была высказана Р.Викнером [Wickner, 1994].
Фактор [PSI+] представляет собой прионную формуфактора терминации трансляции eRF3 - продукта гена SUP35 [Zhuravleva et al.,1995]. В прионной форме белок Sup35 частично инактивирован и не можетэффективно функционировать в качестве вспомогательного фактора терминациитрансляции eRF3. В этом случае в клетках штамма, маркированного нонсенсмутацией (например ade1-14), рибосома с определѐнной частотой прочитываетпреждевременный стоп-кодон UGA как значащий, в результате чего образуетсяполноразмерный белок Ade1 и клетки приобретают способность расти на средебез аденина. Таким образом, прионизация Sup35 вызывает наследуемоеизменение признака и может детектироваться на фенотипическом уровне (см. рис.6).В рамке считывания, соответствующей белку Sup35 (685 а.
к.), принятовыделять три домена, начинающихся с остатка метионина: N (1-123 а. к.), M (124253 а. к.), C (254-685 а. к.) [Kushnirov et al., 1988]. С-домен необходим дляподдержания жизнеспособности клетки и выполняет функцию фактора eRF3 втерминации трансляции, он консервативен у всех эукариот и имеет высокую47степень сходства с фактором элонгации трансляции EF-1А эукариот и EF-Tuпрокариот. N- и M-домены несущественны для жизнеспособности клеток [TerAvanesyan et al., 1993]. N-домен необходим для прионизации белка, он содержитучастки, обогащѐнные Q/N и олигопептидные повторы из 9 аминокислотныхостатков PQGGYQQYN [Кushnirov et al., 1988;Ter-Avanesyan et al., 1994].[psi-]ade1-14[PSI+]SUP35SUP35ade1-14мономеры Sup35агрегаты Sup35-AdeYPDYPD-AdeРисунок 6.
Фенотипическое проявление прионизации белка Sup35.Пояснения: Мономеры белка Sup35 в нормальной клеточной конформацииизображены в виде красных кружков. Мономеры Sup35 в прионной изоформеизображены в виде красных квадратов. Жѐлтой четырѐхконечной звѐздочкойобозначен преждевременный кодон UGA в гене ADE1 и в соответствующейпоследовательности РНК.Аспарагин-глутамин богатый участок необходим для индукции и передачив ряду поколений прионных свойств Sup35.
Делеционный анализ Sup35 показал,что минимальный фрагмент, достаточный для индукции [PSI+], включаетаспарагин-глутамин богатый участок и первые два олигопептидных повтора. Для48поддержания [PSI+] необходимо наличие всех пяти олигопептидных повторов[Osherovich et al., 2004]. Одно из характерных свойств приона [PSI+] –зависимость от уровня экспрессии гена HSP104 [Chernoff et al., 1995]. Передача[PSI+] дочерним клеткам требует оптимального уровня продукции шаперонаHsp104, необходимого для разрезания агрегатов Sup35 и образования т.н.«прионных зерен» – небольших агрегатов, за счет которых происходит передачаприона в дочернюю клетку при клеточном делении.Агрегаты белка Sup35, как выделенные из клеток штамма [PSI+], так иполученные in vitro, при введении их в клетки дрожжей с помощью методабелковой трансформации индуцируют прионизацию клеточного белка Sup35[King and Diaz-Avalos, 2004].
Эти же эксперименты показали, что наличиевариантов прионов у дрожжей связано исключительно со структурнымиособенностями прионных агрегатов Sup35, и не зависит от других белков.1.4.2.3.Фактор [PIN+]В экспериментах И. Л. Деркач с соавторами было показано, что индукцияфактора [PSI+] при сверхэкспрессии полноразмерного гена SUP35 зависит отналичия другого прионоподобного элемента - [PIN+] ([PSI+] inducibility) [Derkatchet al., 1997]. Фактор [PIN+], также как и фактор [PSI+], передаѐтся с цитоплазмой,изгоняется под воздействием GuHCl и способен возникать в клетках [pin-] de novo.В отличие от фактора [PSI+], к элиминации фактора [PIN+] приводит толькоделеция гена HSP104, но не его сверхэкспрессия.Данные о молекулярной природе фактора [PIN+] были получены врезультате работ двух исследовательских групп.
В 2000-м году было показано,что белок Rnq1 присутствует в некоторых дрожжевых штаммах в мономерномсостоянии, а в других штаммах образует агрегаты [Sondheimer and Lindquist,2000]. В работе других исследователей было доказано, что именно прионнаяформа белка Rnq1 выполняет функцию фактора [PIN+], т.е. прионизация этого49белка способствует прионной конверсии Sup35 в случае его сверхпродукции[Derkatch et al., 2001].В белке Rnq1 выделяют два домена: N-терминальный (1-152 а.к.) и Стерминальный (153-405 а.к.), богатый Asn/Gln и способный к переходу вприонную конформацию [Sondheimer and Lindquist, 2000].
Какие-либо функцииэтого белка, не связанные с участием в прионизации eRF3, неизвестны, однакодиплоиды, гомозиготные по делеции гена RNQ1, образуют восьмиспоровые аски счастотой 1-4% [Orlowska-Matuszewska and Wawrzycka, 2006]. Прионная природафактора [PIN+] была подтверждена в экспериментах по трансформации клетокдрожжей [pin-] агрегатами белка Rnq1, полученными in vitro, и экстрактамиклеток, несущих фактор [PIN+]. В обоих случаях экзогенные агрегаты белка Rnq1индуцировали прионизацию [Patel and Liebman, 2007].1.4.2.4.Фактор [SWI+]Фактор [SWI+] представляет собой прионную форма белка Swi1, входящегов эволюционно консервативный АТФ-зависимый хроматин-ремодулирующийкомплекс SWI/SNF, участвующий в транскрипционной регуляции примерно 6%генов дрожжей S. cerevisiae. Интересно отметить, что по приблизительнымоценкам в дрожжевой клетке представлено всего порядка 80 молекул белка Swi1,но тем не менее прионные агрегаты [SWI+] (по всей вероятности олигомеры)стабильно передаются в ряду клеточных поколений.
Фактор [SWI+] доминантен испособенпередаватьсяинактивацияSwi1цитоплазматическивызываетзадержку[Duростаetal.,2008].штаммовнаПрионнаясредахснеферментируемыми источниками углерода, такими как раффиноза и галактоза, атакже приводит к нарушению споруляции [Du et al., 2008]. Сверхпродукция Swi1не способствует заметному повышению частоты индукции фактора [SWI+], однаковозникновение приона отмечается в результате трансформации штаммов [swi-]амилоидными фибриллами N-терминального фрагмента белка Swi1 [Du et al.,502010].
Было показано, что для поддержания приона [SWI+] необходима идостаточна продукция аспарагин-обогащѐнного фрагмента Swi1, содержащеговсего 37 N-терминальных аминокислот этого белка [Crow et al., 2011].Клетки дрожжей утрачивают фактор [SWI+] при инкубации на среде сGuHCl, или в результате делеции гена HSP104. Кроме того, данный прион свысокой частотой теряется при тепловом шоке и в результате изменения уровняпродукции шаперонов семейства Hsp70 [Hines et al., 2011].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
