Диссертация (1144700), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1 А) и антипараллельной ориентации (рис. 1Б). При образовании межмолекулярных бета структур карбоксильные иаминогруппы аминокислот взаимодействующих молекул белка формируютводородные связи [Kajava et al., 2010]. Вероятно, радикалы аминокислот вформировании таких связей не участвуют, но этот вопрос изучен не достаточнополно. Для большинства исследованных амилоидных структур с той или инойстепеньюдостоверностидоказанапараллельнаяориентацияцепей(такназываемая структура “parallel in register” [Wickner et al., 2010]. Вместе с тем,совсем недавно появились доказательства, что некоторые амилоиды формируютантипараллельные структуры [Gu et al., 2014].
Показано также, что амилоидымогут формировать структуру спирали [Van Melckebeke et al., 2010; Saupe, 2011].В этом случае бета слой формируется за счѐт связывания N-терминальнойпоследовательности одного мономера с C-терминальной последовательностьюдругого мономера.15Рисунок 1. Схематическое расположение мономеров одного и того же белка впараллельной (А) и антипараллельной (Б) ориентации в составе амилоиднойфибриллы.Водородныемежмолекулярныесвязиобозначеныкраснымичѐрточками.Есть экспериментальные основания полагать, что последовательности,образующие бета слои, укладываются в виде так называемых «арок» (рис.
2),структура которых может стабилизироваться за счѐт внутримолекулярныхвзаимодействий[Kajavaetal.,2010].Типичнаяамилоиднаяфибриллапредставляет собой гомополимер [Wickner et al., 2010], хотя нельзя исключать,что фибриллы могут включать мономеры другого белка, с гомологичными илисходными аминокислотными последовательностями.16Рисунок 2. «Арочная модель» укладки последовательностей, формирующих бетаслои. [по Kajava et al., 2010].Следует отметить, что наряду с альфа спиралью, бета слои являются однойиз форм укладки белка, и большинство белков содержит последовательности,формирующиезаключаетсятакиевтом,вторичныечтоониструктуры.образуютсяУникальностьзасчѐтамилоидовформированияневнутримолекулярных, а межмолекулярных упорядоченных бета слоѐв.
Нередкоприходится встречать утверждение - «любой белок может формироватьамилоидные агрегаты». В этом утверждении есть лишь небольшое зерно истины сточки зрения химика, который ставит эксперименты in vitro, однако с точкизрения биолога, оно лишено смысла. Биолог имеет дело с живыми объектами, и invivo, даже в условиях сверхпродукции, лишь немногие белки образуютамилоидные агрегаты.
Более того, даже in vitro при широком варьированииусловий (солевого состава буферов, кислотности и температуры) далеко не всякийбелок или пептид может формировать амилоидные фибриллы [Maji et al., 2009].Амилоидогенныесвойстваопределяетаминокислотныйсостав17последовательностиполипептидов.наибольшимамилоидогеннымобогащѐнныегидрофобнымиЭкспериментальнопотенциаломобладаютаминокислотами,такимиустановлено,чтопоследовательности,какфенилаланин,изолейцин и валин, а наименьшим - обогащѐнные заряженными аминокислотами[Ahmed and Kajava, 2013].
Такая аминокислота как пролин вообще не образуетбета связей и, соответственно, препятствует амилоидогенезу, так как у неѐотсутствует стандартная аминогруппа.Разработанонесколькотеоретическихалгоритмов,позволяющихпредсказывать способность полипептидов к амилоидогенезу, но эти алгоритмыудовлетворительно работают только для коротких пептидов [по: Ahmed andKajava, 2013]. Есть основания полагать, что амилоидные свойства белка,определяют не только последовательности способные образовывать бета слои, нои соседние участки полипептидной цепи.
Таким образом, теоретическиепредсказания в настоящее время малоэффективны.Большинствовыявленныхамилоидовдемонстрируют цитотоксические эффектыявляютсяпатогеннымии[по: Нижников и др., 2015].Образование патогенных амилоидных полимеров чаще всего может быть вызванодвумя причинами – аномальным повышением концентрации амилоидогенногобелка, или возникновением аминокислотных замен, способствующих агрегации.Вместе с тем, у некоторых организмов выявлены как конститутивныефункциональные амилоиды, так и функциональные амилоиды, формированиекоторых индуцирует внешнее воздействие [Sugiyama and Tanaka, 2014].Для амилоидов можно выделить несколько универсальных физикохимических свойств [по: Нижников и др. 2015]:- поперечная исчерченность, которая определяется поперечным расположениеммономеров белка по отношению к центральной оси протофибриллы;- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красныйи тиофлавин Т;18-высокийуровеньустойчивостиквоздействиюионныхдетергентов,растворяющих почти все белковые комплексы и агрегаты, но не амилоидныефибриллы;- способность к автокаталитическому росту за счѐт присоединения свободныхмономеров к протофибрилле [McLaurin et al., 2000].Отметим, что при присоединении к амилоидной протофибрилле мономеризменяет конформацию, что зачастую приводит к инактивации белка, или кприобретению белком новых функций [по: Winklhofer et al., 2008].
Длябольшинстваисследованныхбелковестьполныйспектрдоказательствамилоидных характеристик фибрилл, полученных in vitro, а в экспериментах invivo показано лишь связывание с амилоидспецифическими красителями. Этообъясняется серьѐзными методическими сложностями выделения и очисткиамилоидов от прочих белков.1.2.Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидовВпервые термин «Prion» (“proteinaceousinfectious (particles)”) былпредложен Стенли Прусинером для описания особой формы одноимѐнного белкаPrP(PrionProtein),вызывающейинфекционныенейродегенеративныезаболевания человека и животных.
Прионная форма белка была обозначена PrPSc(от первого описанного прионного заболевания овец “Scrapie”). Нормальнаяформа белка PrP обозначается PrPC (от Cellular) [по: Prusiner and Scott, 1997].Согласно определению С. Прусинера «прионы – это инфекционные белковыечастицы», которые способны к самовоспроизведению. Эти инфекционныечастицы представляют собой амилоидные агрегаты белка Prion Protein. АгрегатыPrPSc удивительно устойчивы и могут передаваться от организма к организмудаже принадлежащим разным видам.
Инфекционные частицы PrPSc содержатсяне только в мозге, но и в других органах и тканях, а также в выделенияхлимфатической системы и фекалиях [по: Aguzzi et al., 2008]. Большинство19выявленных впоследствии у разных организмов белков, подпадающих подопределение «прион» (т.е. инфекционная белковая частица), формируютамилоидные агрегаты.Рассмотрим основные сходства и различия понятий «амилоид» и «прион».
Впервую очередь нужно заметить, что описаны некоторые прионы, не обладающиеамилоидными свойствами [Brown and Lindquist, 2009], а возникновениедрожжевого приона [β] вообще не связано с конформационными изменениями[Roberts and Wickner, 2003]. Подробнее об этом будет сказано в разделе«Прионы». Здесь мы сосредоточимся на обсуждении отличительных чертинфекционных и неинфекционных амилоидов.Инфекционнымиявляютсятолькотеагенты,которыеспособныразмножаться в организме-хозяине. Классическими примерами инфекционныхагентов являются бактерии, патогенные грибы, бактерии и вирусы. Посколькуприоны являются инфекционными белковыми частицами, то само определениепостулирует способность этих частиц (иначе говоря, амилоидных агрегатов)размножаться, то есть самовоспроизводиться.
Именно размножение прионныхчастиц объясняет распространение прионных инфекций у млекопитающих [Sun etal., 2008] и передачу прионной формы белка в ряду поколений у микроорганизмов[Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Если говорить о S. cerevisiae, то прионныйагрегат, образовавшийся в одной клетке, стабильно передается всем еѐ потомкамв ряду клеточных поколений, что однозначно доказывает наличие механизма,обеспечивающего размножение, то есть расщепление прионного агрегата.
Дляописания прионизации белка PrP было предложено две базовые модели,получивших название «гетеродимерной» и «полимеризационной» [Prusiner, 1989;Lansbury and Caughey, 1995] (рис. 3).20Рисунок 3. Модели, объясняющие передачу приона [по: Chernoff , 2001].Отметим,что«полимеризационная»модельотражаетмеханизмамилоидогенеза, но никак не объясняет механизм передачи приона, которыйдолжен включать в себя не только рост полимера, но и увеличение количестваприонных частиц. Согласно «гетеродимерной»модели два мономера белкавзаимодействуют, что приводит к изменению их конформации, далее изменѐнныемономеры разделяются и служат матрицами для присоединения и конверсииновых мономеров. Эта модель оказалась ошибочной – как было показано в рядеработ,свободныемономерыбелканеспособнысохранятьприоннуюконформацию.
Если говорить об амилоидных прионах, то, как мы понимаемтеперь, бета-структуры молекул, формирующих прион, сохраняются лишь всоставе полимеров.Гипотеза, объяснившая механизм размножения амилоидных прионов, былапредложена В. Кушнировым и М. Тераванесяном [Kushnirov and Ter-Avanesyan,1998]. Основываясь на экспериментальных данных, авторы предположили, что вклетках дрожжей прионные агрегаты расщепляет на олигомеры шаперон Hsp104.Делеция гена, кодирующего этот шаперон, приводит к утрате приона, посколькуамилоидные агрегаты перестают расщепляться и не могут передаваться из клеткив клетку. Позднее было показано, что Hsp104 в комплексе с другими шаперонами21обеспечиваетрасщеплениеагрегатовбольшинствадрожжевыхприонов[Romanova and Chernoff, 2009]. Размножение агрегатов приона млекопитающих(т.е.
увеличение количества инфекционных частиц) было доказано приинфицировании иммортализованной культуры клеток патогенными агрегатамиPrPSc. У потомков инфицированных клеток прионный белок был представлен вамилоидной изоформе PrPSc [Butler et al., 1988]. Факторы, обеспечивающиерасщепление агрегатов PrPSc по-прежнему остаются неизвестными. Былопоказано, что агрегаты PrPSc могут расщепляться in vitro при механическомвоздействии, а также в результате активности шаперона альфа-кристаллина [Sunet al., 2008], однако эта работа не получила продолжения.
Именно расщеплениеприонных агрегатов на олигомеры, приводящее к увеличению количестваинфекционных частиц, является ключевым отличием прионов от классическихамилоидов. Эту мысль иллюстрирует схема, приведѐнная на рисунке 4.На этапе инициации процессы амилоидогенеза и прионогенеза ничем неотличаютсядруготдруга.Вслучаеформированияконститутивныхфункциональных амилоидов уровень продукции белка оказывается достаточнымдля того, чтобы мономеры связались друг с другом за счѐт формированиямежмолекулярных бета слоѐв. Образовавшаяся затравка присоединяет новыемономеры, что приводит к формированию олигомера и протофибриллы (рис. 4,этап 1).22Рисунок 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
