Диссертация (1144700)
Текст из файла
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования«Санкт-Петербургский государственный университет»На правах рукописиГалкин Алексей ПетровичИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ ИАМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙSACCHAROMYCES CEREVISIAEСпециальность 03.02.07 – генетикадиссертация на соискание учѐной степенидоктора биологических наукНаучный консультант:Академик РАН С.Г. Инге-ВечтомовСАНКТ-ПЕТЕРБУРГ20152ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ5Глава 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и 13различия1.1. Амилоиды131.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов181.3.Функциональные и патологические амилоиды271.3.1. Функциональные амилоиды271.3.2. Патологические амилоиды311.3.2.1. Системный амилоидоз АА311.3.2.2. Латеральный склероз321.3.2.3. Болезнь Альцгеймера321.3.2.4. Болезнь Хангтингтона361.4. Прионы371.4.1.
Прионы млекопитающих371.4.1.1. Прионный белок PrP371.4.1.2. Альфа – синуклеин401.4.1.2.Белок tau411.4.2. Прионы низших эукариот421.4.2.1. Фактор [URE3]441.4.2.2. Фактор [PSI+]461.4.2.3. Фактор [PIN+]481.4.2.4. Фактор [SWI+]491.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3+], [OCT+] и [MOD+]501.4.2.6.
Факторы [β] и [GAR+]521.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina531.4.3. Функциональная значимость прионов551.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на 59регуляцию протеомных сетей31.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании 65прионов и амилоидовГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ682.1.
Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования682.2. Плазмиды762.3. Методы дрожжевой генетики862.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени872.5. Метод бицистронной люминесценции882.6. Флуоресцентная микроскопия892.7. Иммунохимический анализ белков.912.7.1. Выделение белка из дрожжей912.7.2. Дифференциальное центрифугирование932.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы К932.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация932.8. Протеомный метод выявления и идентификации амилоидов PSIA962.8.1.
Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке 97ионными детергентами2.8.2. Разделение и идентификация белков982.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE)982.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE1002.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией 101(LC-MALDI)2.9. Статистические методы102ГЛАВА3.103ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Прионный фактор [NSI+]3.1.1.Выявлениеихарактеристика103дрожжевогоэпигенетического 103детерминанта [NSI+]3.1.2. A-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]10643.1.3.
[NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции1073.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+]1103.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+]1183.1.5.1.Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых 118влияет на фенотипическое проявления [NSI+]3.1.5.2.
Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия 121которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-]3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в 126дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов» 1263.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме 137[NSI+]3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые 137агрегаты в штамме [NSI+]3.2.2.2.
Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+]1413.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+]1463.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных 154агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo 157амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом Aβ в дрожжах S. cerevisiaeЗАКЛЮЧЕНИЕ166ВЫВОДЫ171СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ172СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1755ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияАмилоиды представляют собой белковые полимеры, которые формируютсяза счѐт образования упорядоченных межмолекулярных бета-складчатых слоѐв[по: Baxa, 2008].
Инфекционные амилоидные полимеры (прионы), в отличие отнеинфекционных, расщепляются на олигомеры, которые в свою очередьспособны присоединять и конвертировать новые мономеры белка в амилоиднуюизоформу [по: Галкин и др., 2006]. Прионы и неинфекционные амилоидывыявлены у самых разных организмов и, зачастую, их формирование вызываетцитотоксический эффект. Согласно медицинской классификации болезни,связанные с образованием межклеточных амилоидных агрегатов, принятоназывать«амилоидозами»,тогдакакпатологии,которыеопределяютсянакоплением внутриклеточных амилоидов, относят к «амилоидозоподобным»заболеваниям [Sipe et al., 2014]. К числу наиболее социально значимыхамилоидных заболеваний относятся болезни Альцгеймера и Паркинсона, а такжеприонные болезни.
В настоящее время известно более 30 различных амилоидныхзаболеваний человека [Eisenberg and Jucker, 2012]. У дрожжей S. cerevisiaeохарактеризовано восемь белков, которые могут формировать прионные агрегатыи вызывать наследуемые эпигенетические изменения, которые стабильнонаследуются в ряду поколений [Нижников и др., 2015].Открытиеинфекционныхамилоидов(прионов)уодноклеточныхорганизмов привело к созданию новой концепции «белковой наследственности»[Wickner, 1994]. Согласно этой концепции, в случае прионизации белокинактивируется или изменяет свои функции, что вызывает наследуемоеизменение признака без каких бы то ни было изменений в геноме [Wickner, 1994].Открытие прионов поколебало центральную догму биологии – в случае прионнойконверсии перенос информации идѐт непосредственно от белка к белку [ИнгеВечтомов, 2013].6Актуальность исследования процесса амилоидогенеза связана также с тем,что возникновение одних амилоидов зачастую индуцирует агрегацию другихамилоидогенных белков [Derkatch et al., 2001] и провоцирует глобальныеизменения в регуляции протеомных взаимодействий [Nevzglyadova et al., 2009].Работы последних лет свидетельствуют о том, что некоторые амилоиды могутвыполнять жизненно-важные функции, в частности амилоидные конформерыCPEB и Orb2 регулируют долговременную память у Aplysia californica иDrosophila melanogaster, соответственно [Si et al., 2010; Mastushita-Sakai et al.,2010; Majumdar et al., 2012].
Несмотря на определѐнные успехи в исследованииамилоидогенеза, из-за отсутствия универсальных биохимических методов поискаамилоидов, имеющиеся данные носят разрозненный характер и не позволяютоценить распространѐнность и значимость амилоидов в живой природе. Нашаработа посвящена решению таких актуальных задач, как идентификацияамилоидов в масштабах протеома и анализ их взаимодействия in vivo.Степень разработанности темыИдентификация каждого нового приона или неинфекционного амилоидакрайне трудоѐмка и является заметным научным событием. У млекопитающихновые амилоиды выявляются либо в результате исследования биохимическихсвойств отдельных белков, либо вследствие анализа состава патологическихбелковых депозитов [Glenner et al., 1984; McKinley et al., 1983].
Дрожжевыеприонные белки обычно выявляют в результате генетических скрининговфакторов, стабильно передающихся в ряду поколений и демонстрирующихнеменделевское наследование [Derkatch et al., 1997; 2001; Rogoza et al., 2010;Suzuki et al., 2012]. С помощью генетических подходов можно выявлять лишь тебелки, амилоидогенез которых вызывает видимые фенотипические изменения вконкретной модельной системе. Такой подход не является системным и не можетдать полного представления о распространѐнности и значимости амилоидов врегуляции физиологических и патологических процессов.
Прогресс в данном7направленииисследованийбиохимическогометодаможетскринингаобеспечитьиразработкаидентификацииуниверсальногоинфекционныхинеинфекционных амилоидов в протеоме различных организмов. Принцип дляразработкибиохимическогометодавыявлениянеизвестныхамилоидов,основанный на их уникальной устойчивости к обработке додецилсульфатомнатрия (SDS), был предложен в работе лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна[Kushnirov et al., 2006].
Этот подход позволил выявлять сверхпродуцирующиесяамилоидные белки, но оказался не достаточно чувствительным [Kushnirov et al.,2006]. Недавно подход, основанный на SDS-устойчивости амилоидных фибрилл,был усовершенствован, что позволило выявить некоторые глутамин-аспарагинобогащѐнные белки, образующие прионные агрегаты в дрожжах [Kryndushkin etal., 2013].
Вместе с тем, этот метод даѐт много ложно-позитивных результатов иего нельзя считать универсальным, поскольку известны амилоиды неустойчивыек обработке SDS [Kryndushkin et al., 2013].Исследование взаимодействия амилоидов представляет особый интерес сбиомедицинской точки зрения, поскольку экспериментально доказано, чтовозникновение патологических амилоидных агрегатов одного белка можетспособствовать амилоидогенезу других белков [Derkatch et al., 2001]. Показано,что индукции амилоидогенеза за счѐт взаимодействия мономеров одного белка спредсуществующим амилоидным агрегатом другого белка способствует сходствоих аминокислотных последовательностей [Kovacs et al., 2002; Rank et al., 2002;Giasson et al., 2003; Schwarze-Eicker et al., 2005].
Согласно предложенной модели,амилоиды являются «затравкой» для присоединения мономеров другого белка,что способствует физическому сближению мономеров, изменению конформациии агрегации [Derkatch et al., 2001]. Вместе с тем, теоретические предсказаниятакого рода взаимодействий на нынешнем уровне наших знаний невозможны.Недавно было показано, что предсуществующие амилоидные агрегаты могутиндуцировать агрегацию других белков не только за счѐт механизма «затравки».Так, прионизация дрожжевого транскрипционного регулятора Mod5 способствуетприонизации Sup35, хотя физически эти белки не взаимодействуют [Arslan et al.,82015].
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
