Диссертация (1144700), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Механизмы, определяющие такого рода взаимодействия, пока остаютсянеисследованными.Изучение взаимодействия амилоидогенных белков в экспериментах натрансгенныхживотныхсопряженосопределѐннымиметодическимисложностями, занимает много времени и требует больших материальных затрат.Использование иммортализованных культур клеток для этих целей не всегдавозможно, поскольку патологические амилоиды убивают клетки. Экспериментыin vitro безусловно помогают ответить на определѐнные вопросы, но имеют рядограничений, и их результаты не всегда воспроизводятся in vivo.
Наибольшийпрогресс в исследованиях взаимодействий прионов и неинфекционных амилоидовin vivo достигнут благодаря использованию дрожжевой модельной системы [IngeVechtomov, 2011].Цель и задачи работыЦелью работы является идентификация прионов и неинфекционных амилоидов впротеоме дрожжей, а также анализ взаимодействия амилоидогенных белковмлекопитающих in vivo в дрожжевой модельной системе.В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:1. Выявление и характеристика новых наследуемых изменений признаков,опосредованных прионизацией белков дрожжей S. cerevisiae.2.
Идентификация белков, прионизация которых вызывает наследуемыеизменения признаков.3. Разработка универсального метода протеомного скрининга амилоидов и егоиспользованиедляидентификацииобладающие амилоидными свойствами.белков,образующихагрегаты,94. Проверка адекватности дрожжевой модели для анализа взаимодействиябелков млекопитающих, формирующих амилоидные агрегаты.Научная новизнаВрезультатепроведѐнныхисследованийвпервыепоказано,чтовзаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] вызывает наследуемое изменениепризнака.Предложенагипотеза,объясняющаямеханизмприонныхвзаимодействий.
Показано, что белки Rnq1 и Swi1 в прионной формеприобретают новую, ранее не охарактеризованную функциональную активность.Выявлен список белков, которые демонстрируют амилоидные свойства in vivo иявляются кандидатами на роль функциональных амилоидов дрожжей S. cerevisiae.Разработана и успешно апробирована новая методология, позволяющая выявлятьиидентифицироватьприоныинеинфекционныеамилоидыразличныхорганизмов. В дрожжевой модельной системе выявлены аминокислотныепоследовательностиприонногобелкамлекопитающих,ответственныезавзаимодействие патогенных агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета(Aβ), агрегация которого связана с болезнью Альцгеймера.Теоретическая и практическая значимость работыПолученныевработерезультатыдополняюттеориюбелковойнаследственности. Предложена концепция, согласно которой функциональныевзаимодействия прионов, опосредованные другими компонентами протеомнойсети, вызывают наследуемые изменения признаков.
Показано, что эффектыфункционального взаимодействия прионов могут быть описаны в рамкахтрадиционной классификации генных взаимодействий. Охарактеризованное внашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] в дрожжах может являтьсяудобной модельной системой для исследования закономерностей, определяющихвзаимодействиеамилоидовчеловека,вызывающихсоциально-значимые10амилоидные заболевания.
Теоретическая значимость работы определяется такжевыявлением в протеоме дрожжей S. cerevisiae ряда белков, являющихсяпотенциальными кандидатами на роль функциональных амилоидов.Практическая значимость работы определяется тем, что разработаннаяметодология протеомного скрининга амилоидов открывает широкие перспективыдля выявления функциональных и патологических амилоидов у различныхбиологических объектов и позволяет оценить распространѐнность и значимостьявлений прионогенеза и амилоидогенеза в живой природе.
В частности,разработанный нами подход может быть использован для выявления ещѐ неохарактеризованных амилоидов, вызывающих заболевания человека, этиологиякоторых пока неизвестна. Выявление аминокислотных последовательностейприонного белка млекопитающих, ответственных за регуляцию физическогосвязывания патологических агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета,может иметь значение для разработки новых подходов к лечению ипредотвращению амилоидных заболеваний.Методология и методы исследованияВ работе использованы стандартные методы классической и молекулярнойгенетики дрожжей и разработаны новые подходы для протеомного скрининга иидентификации амилоидов у различных организмов. В частности, в работеиспользовали классические методы культивирования E.coli и S.
cerevisiae[Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990], стандартный набор методов геннойинженерии [Sambrook et al., 1989], различные вариации методов выделения белка,электрофореза в агарозном и акриламидном геле, Вестерн-блот гибридизации[Rubel et al., 2013]. Для сравнительного анализа уровня транскрипцииисследуемых генов, а также для оценки эффективности терминации трансляции,использовали методы ПЦР в реальном времени [Livak and Schmittgen, 2001] ибицистронной люминесценции [Valouev et al. 2009], соответственно. Для анализа11взаимодействия амилоидных белков in vivo применяли методы флуоресцентноймикроскопии и метод FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [Roszik et al.,2013]. Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнениевыборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили припомощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0.
(“StatSoftInc.”, США).Разработана новая методология для выявления и идентификации вмасштабах протеома белков, формирующих амилоидные агрегаты in vivo. Этотподход объединяет ряд биохимических и протеомных методов, в частности,ультрацентрифугированиеустойчивыхбелковыхбелковогоагрегатов,лизата,очисткудвумерныйфракцииэлектрофорездетергентокрашенныхфлуорохромами белков, расщепление сложных белковых смесей на пептиды, ихразделениеметодомHPLCиидентификациюбелковметодоммасс-спектрометрии.Положения, выносимые на защиту1.Дополненатеориябелковойнаследственности–установлено,чтовзаимодействие прионов может вызывать наследуемые изменения признаков.2.Белки Rnq1 и Swi1 в результате прионизации приобретают новуюфункциональную активность.3.С помощью новой методологии в протеоме S. cerevisiae идентифицированыбелки, демонстрирующие амилоидные свойства и являющиеся кандидатами нароль функциональных амилоидов.4.
Показана адекватность использования дрожжевой модели для исследованияагрегации и взаимодействия гетерологичных амилоидов.12Степень достоверности и апробация результатовПолученные результаты достоверны и были представлены в виде устныхдокладовнаследующихроссийскихимеждународныхконференциях:«Нобелевские чтения» 2003, Санкт-Петербург; XXI th YGM Conference, 2003,Гетеборг, Швеция; 2-я конф. МОГиС «Актуальные проблемы современнойгенетики», 2003, Москва; “Prion 2006”, Турин, Италия; V съезд ВОГиС, 2009,Москва; «Нейронаука для медицины и психологии», 2012, Судак, Украина; FEBSCongress, 2013, Санкт-Петербург; VI Съезд ВОГиС, 2014, Ростов-на-Дону.
Крометого, результаты представлены в виде стендовых сообщений на другихмеждународных конференциях и опубликованы в виде тезисов. Результатыпредставлены также в докладах на заседании президиума Санкт-Петербургскогонаучного центра РАН в 2011 г, на заседании по программе Президиума РАН«Фундаментальные науки – медицине», 2010, Москва, в приглашѐнном докладе вGeorgia institute of Technology, США, 2008 и на научных семинарах кафедрыгенетики и биотехнологии СПбГУ.Результаты опубликованы в тринадцати научных статьях в международных иотечественных рецензируемых журналах и включены в главу монографии.Оформлен патент на изобретение РФ №- 2294964.13Глава1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и различия1.1.АмилоидыИсходно термин «амилоид» (крахмалоподобный) был предложен МатиасомШлейденом в 1838 году для описания конгломератов крахмала, в нормеприсутствующих в клетках растений [по: Sipe and Cohen, 2000]. Рудольф ЛюдвигКарлВирховв 1854году распространилэтот терминдляописанияпатологических отложений в печени, которые подобно крахмалу окрашивалисьйодом [по: Andree and Sedivy, 2005]. Достаточно скоро стало понятно, чтоамилоидные включения, формирующиеся в различных органах и тканях человека,не содержат вещества сходного с крахмалом [Sipe and Cohen, 2000].Молекулярная природа амилоидов стала окончательно понятна относительнонедавно, после внедрения в медицину и биологию метода твѐрдофазного ядерногомагнитного резонанса.С точки зрения молекулярной биологии амилоиды представляют собойупорядоченныебелковыефибриллы,вкоторыхбета-складчатыелистыформируются за счѐт образования межмолекулярных водородных связей.
Врезультатеприсоединениякамилоидномуолигомеруновыхмономеровобразуются поперечно исчерченные протофибриллы, которые объединяются вфибриллы и крупные амилоидные агрегаты. Межмолекулярные связи образуютодни и те же последовательности взаимодействующих мономеров, что определяетупорядоченность амилоидных агрегатов [Kajava et al., 2010]. Вместе с тем,трактовкатермина«амилоид»по-прежнемунеоднозначна.Фибриллыамилоидогенного белка обычно связывают ряд других белков, в том числепротеогликаны, что и объясняет окрашивание амилоидов йодом [Snow et al.,1994]. В связи с этим, зачастую в биомедицинской литературе амилоидаминазывают весь комплекс белков, связанных с фибриллой амилоидогенного белка.Более того, в соответствии с современной медицинской классификациейамилоидамипринятосчитатьлишьмежклеточныеагрегаты,окрашиваются амилоид-специфическими красителями [Sipe et al., 2014].которые14В отличие от медицины, для которой характерен оправданный консерватизм,определения, принятые в биохимии и молекулярной биологии, должныосновываться на современных знаниях о молекулярных свойствах исследуемыхсоединений.
Именно поэтому, последние пятнадцать лет в молекулярнобиологической литературе в качестве амилоидов принято рассматривать белковыефибриллы любых организмов, имеющие кросс-бета структуру, вне зависимостиот ассоциированных с ними компонентов, а также от их внутриклеточной,межклеточной или внеклеточной локализации [Lansbury et al., 1995; Kajava et al.,2010; Shewmaker et al., 2011; Syed and Boles, 2014; Knowles et al., 2014]. В нашейработе, посвящѐнной идентификации и анализу взаимодействия амилоидов, мыбудем придерживаться именно такой точки зрения.В качестве иллюстрации амилоидной структуры на рисунке 1 приведеносхематическое изображение бета слоѐв, образующихся в результате связываниядвух мономеров в параллельной (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
