Диссертация (1144700), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Как мы уже обсуждали, одни амилоиды могут инициироватьвозникновение других, но чаще всего такие исследования проводят на фонеискусственно вызванной сверхпродукции одного из взаимодействующих белков.Прионная конверсия транскрипционных регуляторов, таких как Swi1, можетвызывать амилоидогенез других белков не только за счѐт непосредственноговзаимодействия с гетерологичной матрицей, но и в результате изменения уровняпродукции целого ряда белков. Задача выявления комплексных измененийамилоидома также может быть решена за счѐт разработки универсальногобиохимического метода, позволяющего выявлять амилоиды в масштабахпротеома.Несмотря на активные исследования прионных взаимодействий всеизвестные факты сводятся к индукции одним прионом другого. По-прежнему неизвестно – могут ли взаимодействия прионов, подобно взаимодействиямклассических генов, приводить к наследуемым изменениям признаков? Покатакие взаимодействия не описаны.
Анализ взаимодействия патологическихамилоидов млекопитающих in vivo зачастую представляет собой крайне сложнуюи дорогостоящую задачу. Многие паталогические амилоидные агрегаты убиваютклеткимлекопитающих,чтокрайнезатрудняетанализкаких-либовзаимодействий. Эта проблема может быть решена за счѐт использованияадекватных и удобных модельных систем, лишѐнных перечисленных недостатков.67Целый ряд работ, проведѐнных в последние годы, убедительно доказывает, чтодрожжи S. cerevisiae являются наиболее перспективным модельным объектом дляисследования агрегации гетерологичных амилоидогенных белков [Coughlan andBrodsky, 2005; Mason and Giorgini, 2011].
В частности показано, что припродукции в дрожжевой клетке ряд белков млекопитающих формирует агрегаты,обладающие амилоидными характеристиками [Ma and Lindquist, 1999; Meriin etal., 2002; Winderickx et al., 2008; Mallik et al., 2010]. Уровень продукцииамилоидных белков в дрожжах легко регулировать за счѐт использованияразличных индуцибельных промоторов. Важно отметить, что в дрожжахамилоидогенезначинаетсяпрактическисразупослезапускапродукциисоответствующего белка, тогда как в организме млекопитающих процессформирования амилоидов может длиться месяцы и годы.
Кроме того, амилоидныеагрегаты белков млекопитающих не убивают дрожжевые клетки, что позволяетразрабатыватьразличныемодельныесистемыдляскринингафакторов,контролирующих процесс амилоидогенеза. На наш взгляд, дрожжи S. cerevisiaeпредставляютсобойуникальныймодельныйвзаимодействия гетерологичных амилоидов in vivo.объектдляисследования68ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивированияДля культивирования дрожжей использовали стандартные дрожжевыесреды [Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990]: полные среды YAPD (содержитглюкозу в качестве источника углерода) или СПГ (содержит все компонентыполной среды, за исключением глюкозы, замененной на глицерин (24 мл/л));минимальные среды – MD (содержит глюкозу в качестве источника углерода),также MG и MGly, содержащие соответственно галактозу и глицерин в качествеисточника углерода. В селективные среды на основе MD и MG добавляливитамины, микроэлементы, а также, аминокислоты и азотистые основанияпроизводства “Sigma” (США) в следующих концентрациях: аденин – 20мг/л, Lлизин – 30мг/л, урацил – 20мг/л, L-лейцин – 60мг/л, L-триптофан – 20мг/л.Дляиндукцииспоруляциидиплоидныхштаммовиспользовалипреспоруляционную среду и среду с ацетатом калия.Использовали также среды модифицированного состава: среду YAPD с добавлением хлорида гуанидина “QIAGEN” (США) вконцентрации 5 мМ; средуYAPDсдобавлениемциклогексимида“Sigma”(США)вконцентрации 1мг/л;Для отбора цитодуктантов использовали селективную среду ME, или полнуюсреду YPE, в которых глюкоза заменена на 96º этанол (20мл/л) и добавленциклогексимидвконцентрации1мг/л.Аминогликозидныеантибиотикипаромомицин (100 мкг/мл) и генетицин (50 мкг/мл) добавляли в среду для анализароста дрожжей на фоне общего ингибирования трансляции.
Для экспрессииконструкций, находящихся под контролем индуцибельного промотора CUP1, всреды добавляли CuSO4 «РЕАХИМ» (Россия) в концентрациях от 3 до 150 мкМ.69Для культивирования бактерий использовали твѐрдую и жидкую среды LB(Sambrook et al., 1989). Селекцию устойчивых к ампициллину трансформантовпроводили на среде LB с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Дрожжевыештаммы культивировали при температуре 30ºС, штаммы бактерий при 37ºС. Вработе использован штамм Escherichia coli DH5α следующего генотипа: supE44ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 .Генотипы штаммов S. cerevisiae приведены в Таблице 4.
Диплоидныйштамм D931 был получен в результате трансформации штамма GT111 [Chernoff etal., 2000] плазмидой pU-Aβ-Sup35MC. Гаплоидный сегрегант 1-D931 с делециейхромосомной копии гена SUP35, содержащий плазмиду pU-Aβ-Sup35MC, былполучен с помощью метода случайной выборки аскоспор. Штамм 1-1-D931 былполучен как описано в разделе «3.1.» и содержит прионный детерминант [NSI+].Штамм 6-1-1-D931 был получен в результате переключения типа спариванияMATa на MATα у штамма 1-1-D931 за счѐт использования плазмиды YEpHO.Штамм 4-1-1-D931 получен за счѐт замены плазмиды pU-Aβ-Sup35MC на pL-AβSup35MC в штамме 1-1-D931. Штамм 3-4-1-1-D931 получен за счѐт заменыплазмиды pL-Aβ-Sup35MC на pFL38-SUP35P в штамме 4-1-1-D931.
Гаплоидныйсегрегант 1-D933 был получен в результате споруляции диполоида D933 иселекции клона нужного генотипа (см. табл. 4). Гаплоидный штамм 2-1-1-1-D931был получен в результате замены плазмиды pU-Aβ-Sup35MC в штамме 1-1-1D931 на плазмиду pRS315-SUP35MC. Гаплоидные штаммы[nsi-] 1-1-1-D931 [nsi-],1-4-1-1-D931, 1-3-4-1-1-D931,и 1-2-1-1-D931 и 1-2-D934были получены врезультате трѐхкратного пассирования штаммов 1-1-D931, 4-1-1-D931, 1-3-4-1-1D931, 2-1-1-D931 и 2-D934, соответственно, на среде с 5mM GuHCl ипоследующего отбора клонов, утративших способность к росту на селективнойсреде без аденина.
Штамм 2-1-1-D931 получен из штамма 1-1-D931 путѐм заменыплазмиды pU-Aβ-Sup35MC на плазмиду pRS315-SUP35MC. Штаммы 6-1-4-1-1D931 и 7-1-4-1-1-D931, содержащие прионные детерминанты [SWI+] и [PIN+],соответственно, получены в результате трансформации сферопластов штамма 1-41-1-D931 белковым лизатом штамма 1-1-D931 (описание метода белковой70трансформации приведено ниже). Штамм 2-4-1-1-D931 [PIN+] получен путѐмтрансформации сферопластов штамма 1-4-1-1-D931 [pin-] белковым лизатомштамма BY4742 [PIN+].
Штамм 2-2-1-1- D931 получен на основе штамма 2-1-1D931 за счѐт замены плазмиды pRS315-Sup35MC на плазмиду pRS316-Sup35MC.Штамм 1-2-2-1-1-D931 был получен из штамма 2-2-1-1-D931 в результате заменыплазмиды pRS316-Sup35MC на pASB2. Штамм 18-3-2-1-1- D931 получен изштамма 3-2-1-1-D931 в результате замены плазмиды pRS316-Sup35MC на pASB2.Штаммы 4-2-1-1-D931 [NSI+] и 5-2-1-1-D931 [nsi-] были получены в результатезамены плазмиды pRS315-SUP35MC на плазмиду pYCH-U2 в штаммах, 2-1-1D931 [NSI+] и его деривате [nsi-], соответственно.
Штаммы 1-4-2-1-1-D931 и 1-5-21-1-D931 получены из штаммов 4-2-1-1-D931 и 5-2-1-1-D931, соответственно,путем замещения плазмиды pYCH-U2 на плазмиду pNR-ABF1. Гаплоидныйштамм 1P-74-D694, содержащий встроенную в хромосому кассету SUP35 P.m.LEU2 вместо последовательности гена SUP35 S.
cerevisiae, был описан ранее[Derkatch et al., 2000]. Штаммы 1-D934 и 2-D934 являются гаплоиднымисегрегантами штамма D934, полученными с помощью метода случайной выборкиаскоспор. Штамм 1-D932 является гаплоидным сегрегантом штамма D932,полученным с помощью метода случайной выборки аскоспор. Штаммы 7-1-1D931, 9-1-1-D931 и 7-4-1-1-D931 были получены в результате замещенияпоследовательностихромосомныхкопийгеновRNQ1,VTS1иSWI1,соответственно, на последовательность KanMX4 , экспрессия которой вызываетустойчивость дрожжевых клеток к антибиотику генетицину.71Таблица 4. Штаммы S. cerevisiae, использованные в работеШтаммГенотип, эпигенетические детерминанты, описаниеGT111MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 his3/ his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1 lys2/lys2 ura3/ura3leu2/leu2 [pU-Aβ-Sup35MC] [psi-] [PIN+]D931MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 his3/ his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1 lys2/lys2 ura3/ura3leu2/leu2 [pU-Aβ-Sup35MC] [psi-] [PIN+]1-D9311-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [PIN+][NSI+] дериват штамма 1-D9311-1-1-D931[nsi-] дериват штамма 1-1-D9316-1-1-D931MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+ PIN+]4-1-1-D931Дериват штамма 1-1-D931, несущий плазмиду pL-Aβ-Sup35MC вместо плазмиды pU-AβSup35MC1-4-1-1-D931[nsi-] дериват штамма 4-1-1-D9313-4-1-1-D931Дериват штамма 4-1-1-D931, несущий плазмиду pFL38-SUP35P вместо плазмиды pL-AβSup35MC1-3-4-1-1-D931[nsi-] дериват штамма 4-1-1-Д93172Продолжение таблицы 4.2-1-1-1-D931MATα дериват штамма 1-1-1-D931, содержащий плазмиду pL-Aβ-Sup35MC вместо pU-AβSup35MC6-1-4-1-1-D931[SWI+][pin-] дериват штамма 1-4-1-1-Д9317-1-4-1-1-D931[swi-][PIN+] дериват штамма 1-4-1-1-Д9317-4-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 swi1Δ::KanMX4 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pL-Aβ-Sup35MC][PIN+]2-4-1-1-D931[PIN+] дериват штамма 1-4-1-1-D9313-1-1-D931Дериват hsp104Δ::LEU2 штамма 1-1-D9319-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 vts1Δ::KanMX [pU-Aβ-Sup35MC][NSI+]2-1-1-D931MATa sup35 Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [ pRS315-SUP35MC]1-2-1-1-D931[nsi-][pin-] дериват штамма 2-1-1-D9311-2-2-1-1-D931Дериват 2-2-1-1-D931, несущий плазмиду pASB2, [NSI+]18-3-2-1-1- D931 MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pASB2]2-2-1-1- D931MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pRS316-Sup35MC] [NSI+][PIN+]4-2-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [pYCH-U2]73Продолжение таблицы 4.1-4-2-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [NSI+] [pNR-ΔABF1]5-2-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pYCH-U2]1-5-2-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [nsi-] [pNR-ΔABF1]7-1-1-D931MATa sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 rnq1Δ::KanMX [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+][PIN+]7B-D901MATa ade2-28 his3 LEU2 lys 9-21 ura3-525 trp1 cyhR kar1-1 [pin-]D933MATα/MATa sup35Δ::HIS3/sup35Δ::HIS3 his3/his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/ trp1-289 lys2/lys2ura3/ura3 leu2/leu2 [pU-Ab-Sup35MC] [pL-Aβ-Sup35MC] [nsi- ] [PIN+]1-D933MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 [pU-Aβ-Sup35MC] [nsi-][PIN+]GT81-1CMATa ade1–14 his3-Δ200 leu2–3,112 lys2–801 trp1–289 ura3–52 [PSI+][PIN+]GT409[psi-][pin-] дериват штамма GT81-1CBY4742MATα his3-Δ1 leu2-Δ0 lys2-Δ0 ura3-Δ0 [psi-][PIN+]1-BY4742[pin-] дериват штамма BY4742D955MATα// MATa his3-Δ1//his3 leu2-Δ0// leu2 lys2-Δ0// lys2 ura3-Δ0// ura3 trp1-289//+ ade1-14//+sup35Δ::HIS3//SUP35 [PIN+] [SWI+]D956MATα// MATa his3-Δ1//his3 leu2-Δ0// leu2 lys2-Δ0// lys2 ura3-Δ0// ura3 trp1-289//+ ade1-14//+sup35Δ::HIS3//SUP35 mit1Δ::KANMX4//MIT1 [pL-Aβ-Sup35MC] [PIN+] [SWI+]74Продолжение таблицы 4.1-D956MATα his3 leu2 lys2 ura3 trp1-289 ade1-14 sup35Δ::HIS3 mit1Δ::KANMX4MIT1 [pL-AβSup35MC] [PIN+] [SWI+]1-D934MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1 [NSI+]2-D934MATα sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3 leu2 lys2 ura3 trp1 [NSI+]1-2-D934[nsi-][pin-] дериват штамма 2-D9341P-74-D694MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2 ade1-14 his3Δ ura3-52 leu2-3,112 trp1ATCC 201388MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 gas1Δ::GAS1-YFPGAS1-YFPD934MATa/MATa sup35Δ::HIS3/sup35Δ::SUP35P_LEU2 his3Δ/his3 ade1-14/ade1-14 trp1-298/trp1LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [pU-Aβ-Sup35MC] [NSI+]D935MATa/MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2/sup35Δ::SUP35P LEU2 his3/his3 ade1-14/ade1-14trp1/trp1 LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [NSI+]D936MATa/MATa sup35Δ::SUP35P_LEU2/sup35Δ::SUP35P LEU2 his3/his3 ade1-14/ade1-14trp1/trp1 LYS2/lys2 ura3/ura3-52 leu2/leu2-3,112 [nsi-]75Продолжение таблицы 4.D932MATα/MATa SUP35/sup35Δ::HIS3 ADE1/ade1-14 ADE2/ade2-28 HIS3/his3 LEU2/leu2LYS2/lys2 LYS9/lys 9-21 ura3/ura3-525 trp1/trp1-289 CYH/cyhR KAR1/kar1-1[pL-Aβ-Sup35MC][nsi=]1-D932MATα sup35Δ::HIS3 ade1-14 his3 leu2 ura3 trp1-289 cyhR kar1-1 [rho0][pL-Aβ-Sup35MC] [nsi-]Примечание.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
