Диссертация (1144700), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Были использованыплазмиды pDB691 (UGAC), pDB690 (CGAC), pDB720 (UAGC) и pDB721 (CAGC)любезно предоставленные М.Д. Тер-Аванесяном. Эти плазмиды несут тандемно89расположенные гены, кодирующие люциферазы коралла Renilla и жукасветлячка, разделенные стоп-кодоном UGA (pDB691), UAG (pDB720) илизначащим кодоном CGA (pDB690) и CAG (pDB721) (таблица 5) [Keeling et al.2006; Kallmeyer et al.
2006]. Измерения проводили в люминометре сиспользованием набора реактивов Dual Reporter Assay (“Promega”, США).Эффективность считывания стоп-кодона как значащего вычисляли как частноепоказанийактивностилюциферазыRenillaилюциферазысветлячка,экспрессируемых с плазмиды, содержащей стоп-кодон, умноженное на частноепоказанийактивностилюциферазысветлячкаилюциферазыRenilla,экспрессируемых с плазмиды не содержащей стоп-кодон, и умноженное на 100для выражения значения в процентах. Достоверность отличия от контроляпроверяли непараметрическим критерием Манна-Уитни с использованиемпрограммного обеспечения “Statistica” версии 6.0 (“StatSoft”).2.6.Флуоресцентная микроскопияАнализ колокализации флуоресцентных белков, а также эксперименты поизмерениюэффективностиFRET,проводилиприпомощилазерногосканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 «Leica MicrosystemsGmBH» (Германия) и программного обеспечения «LAS AF Application WizardVersion 1.7.0» «Leica Microsystems GmBH» (Германия), на базе центраколлективного пользования СПбГУ «Хромас».
Для детекции CFP или CFPсодержащих белков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 458нм, сигналдетектировали в пределах 461-510 нм, для детекции YFP или YFP содержащихбелков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 514 нм, сигналдетектировали в пределах 518-580 нм.Небольшое количество дрожжевых клеток, после одного – двух днейинкубации на твѐрдой или жидкой селективной среде, растворяли в 7 мклстерильной воды и равномерно распределяли по поверхности стекла. После90высыхания препарат заключали в раствор «VECTASHIELD Mounting Media»фирмы «Vector Laboratories Inc.» (США) и накрывали покровным стеклом.Излишки раствора удаляли с помощью фильтровальной бумаги, после чего краяпокровного стекла заклеивали лаком для ногтей.Для определения частот клеток с видимыми агрегатами белков, слитых споследовательностями GFP, YFP или CFP, микроскоп переводили в режимфазового контраста и случайным образом выбирали поле зрения.
Клеткифотографировали, используя видеокамеру и систему компьютерного анализаизображения. Далее, микроскоп переводили в режим детекции флуорохромовGFP, YFP или CFP и фотографировали то же поле зрения. Подсчѐт общегоколичества клеток в выбранных полях зрения, а также подсчѐт клеток,содержащихфлуоресцентныеагрегаты,проводили,используяфайлыкомпьютерных изображений.Для определения частот колокализации белков, слитых с флуорохромамиYFP и CFP, подсчитывали количество клеток, содержащих оба флуорохрома, атакже количество клеток, в которых локализация агрегатов, маркированных YFPи CFP совпадала. Частоты колокализации определяли как отношение количестваклеток с совпадающей локализацией агрегатов, маркированных YFP и CFP, кколичеству клеток, содержащих оба флуорохрома.Дрожжевые вакуоли окрашивали с помощью красителя FM4-64 (SynaptoRed) “Invitrogen” (США) согласно протоколу [Meriin et al., 2002].
Окраскуядерной и митохондриальной ДНК проводили, используя краситель DAPI“Invitrogen” (США). Окраску эндосом проводили с помощью красителя LisotrackerBlue“Invitrogen”(США)согласнопротоколуирекомендациямпроизводителя. Эндоплазматическую сеть (ЭПС) и аппарат Гольджи (АГ)окрашивали с помощью красителя ER-Tracker™ Red “Invitrogen” (США) согласнопротоколу и рекомендациям производителя. Для детекции флуоресценции DAPI иэндосом, окрашенных Liso-tracker Blue, использовали Ar UV лазер 405 и91детектировали сигнал в пределах 425-475 нм.
Для детекция вакуолярныхмембран, окрашенных SynaptoRed, использовали лазеры DPSS 561, HeNe 633 и594, сигнал детектировали в пределах 615-758 нм (максимум флуоресценции 680нм).Анализ физического взаимодействия белков Aβ-YFP и различных вариантовPrP-CFP методом AB FRET (Acceptor photobleaching fluorescence resonance energytransfer) проводили, используя метод фотовыжигания акцептора [по: Roszik et al.,2013].Эффективностьпередачиэнергиии,соответственно,степеньвзаимодействия белков, оценивали при сравнении интенсивности флуоресценциидонора в присутствии и в отсутствии акцептора.Показатели FRET оценивали в зоне клетки, содержащей цитологическидетектируемый агрегат PrP-CFP, который колокализуется Aβ-YFP.
В областиинтереса(ROI)фотовыжиганиязамерялиакцептора.флуоресценциюДлядонорафотовыжигания(CFP)доакцептораипослеиспользовалиаргоновый лазер с длиной волны 514 нм при максимальной интенсивностисветового потока. Время выжигания составляло 10 сек. Эффективность FRET(FRETeff) рассчитывали по формуле: FRETeff=[Dpost−Dpre]/Dpost.Dpost – это флуоресценция донора после фотовыжигания акцептора,Dpre – флуоресценция донора до фотовыжигания акцептора.2.7.Иммунохимический анализ белков.2.7.1. Выделение белка из дрожжейВыделение суммарного белка из дрожжей проводили методом разрушенияклеток стеклянными шариками.
Дрожжевые культуры выращивали сутки нажидкой среде YAPD, или на среде MD с необходимыми добавками. Клеткипереносиливцентрифужныепробирки“Beckman”(45мл).Добавлялициклогексемид, до конечной концентрации 200 мкг/мл, и качали на шейкере в92течение 20 минут. После этого клетки осаждали в центрифуге “Beckman J2-21” (5мин, 3000 об/мин) при +4° C. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в1 мл циклогексемида (200 мкг/мл) и переносили в микропробирку (1,5 мл).
Послеэтого клетки снова осаждали в центрифуге “Jouan CR3i” (Франция) (5 мин, 3000об/мин) при +4° C. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в 0,5 млледяного лизирующего буфера (50 мM Tris-HCI pH 7,5; 0,1 мM ЭДТА; 5 мMMgCI2; 0,1 мM DTT; 100 мкг/мл РНКазаA; 10 мM KCI; 100 мкг/мл циклогексемид;2 мM PMSF; 1 мM бензамидин; 2 мкг/мл пепстатин A; 10 мкг/мл; леупептин) илибуфера TNE (150 мM NaCl, 50мM Tris-HCl, pH7,5; 2мM ЭДТА; 2 мM PMSF; 1 мMбензамидин; 2 мкг/мл пепстатин A; 10 мкг/мл леупептин).
Полученнуюсуспензию центрифугировали (5 мин, 3000 об/мин) при 4ºС, супернатант сливали,а полученный осадок ресуспендировали в равном объѐме лизирующего или TNEбуфера. Далее, для разрушения клеток к осадку добавляли равный объѐм отмытыхв азотной кислоте стеклянных шариков (glass beads) “Sigma” (США) и проводили9 циклов дизрупции на шейкере по 20 сек, с перерывами не менее 1 мин на льду.Клеточный лизат переносили в пробирки типа эппендорф, дважды отмывстеклянные шарики 150 мкл лизирующего буфера. Полученный клеточный лизатцентрифугировали (5 мин, 3000 об/мин) при 4ºС, супернатант делили на 2 части,одну из которых использовали для анализа, а вторую – для оценки концентрациибелка.Для денатурации белков перед нанесением их на гель или хранением (при 70ºС) к пробам добавляли 1/3 объѐма 4-х кратного буфера для образцов (100 мMTris-HCI pH 6,8, 20% 2-меркаптоэтанол, 8% SDS, 0,2% бромфеноловый синий,40% глицерин), после чего инкубировали 10 минут при 100ºС.Переданализом белков с помощью метода полуденатурирующегоэлектрофореза в агарозном геле к пробам добавляли 1/3 объѐма 4-х кратногобуфера для образцов 2 (50 мM Tris-HCI pH 6,8, 4% SDS, 0,2% бромфеноловыйсиний, 20% глицерин) и инкубировали 7 минут при комнатной температуре.932.7.2.
Дифференциальное центрифугированиеДифференциальное центрифугирование дрожжевых клеточных лизатов[Patino et al., 1996; Chernoff et al., 2002] проводили при 12000 g 30 мин при 4ºС,или в случае с анализом агрегатов Swi1-YFP при 75000 g 50 мин при 4ºС.Надосадочную фракцию переносили в новую пробирку, а к осадку добавлялиравный объѐм лизирующего буфера.2.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы КДля анализа устойчивости белков к действию протеиназы К (ПК) издрожжей выделяли суммарный белок, используя TNE буфер (см.
выше) бездобавления ингибиторов протеаз, или, чтобы уменьшить активность эндогенныхдрожжевых протеаз, добавляли ингибиторы, которые не влияют на работу ПК(0,5х хемостатин и пепстатин А) [Ma and Lindquist, 1999]. Образцы с добавлениемПК в различной концентрации, а также, контрольный образец без ПК,инкубировали 30 минут при 37oC. Для ингибирования ПК в каждую пробудобавляли PMSF до конечной концентрации 0,2 мМ. Далее, в пробы добавляли1/3 объѐма 4х буфера для образцов 1 и инкубировали 10 минут при 100ºС, послечего пробы наносили на гель или хранили при -70ºС.2.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизацияДенатурирующий белковый электрофорез проводили в 10% или 12%полиакриламидном геле в камере “Mini-PROTEAN 3 Cell” “Bio-Rad” (Италия).Белки переносили в трис-глициновом буфере (Laemmli, 1970) с помощью модулядля переноса “Mini-PROTEAN 3 Cell” “Bio-Rad” (Италия) на нитроцеллюлознуюмембрануHybondECLилимембрануPVDFHybond-P“Amersham”94(Великобритания).использовалиДлямаркерориентировочногомолекулярногоопределениявесаразмера“RainBow”белков“Amersham”(Великобритания).Оценку устойчивости агрегатов белков к обработке 3% саркозинатомнатрия или 1% SDS проводили с помощью метода полуденатурирующегобелкового электрофореза в агарозном геле [Kryndushkin et al., 2003] смодификациями [Bagriantsev et al., 2006].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
