Диссертация (1144700), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Расщепление потипу спаривания статистически достоверно не отличалось от 1:1 (χ2 < 3,84). Вконтроле при скрещивании изогенных гаплоидных штаммов [nsi-] были полученыдиплоидные клоны, фенотипа Ade-. Все гаплоидные сегреганты (150 клонов),полученные от таких диплоидов, также имели фенотип Ade-.Дефекты споруляции исследуемых штаммов могут быть вызваны как наличиемфактора [NSI+], так и тем, что жизненно-важный ген Aβ-SUP35MC неинтегрирован в хромосому, а представлен на центромерной плазмиде. Дляпроведения тетрадного анализа были получены штаммы 1-D934 [NSI+] и 1-2-D934[nsi-], содержащие интегрированную в хромосому кассету, включающую генSUP35P.m. и маркерный ген LEU2.
В результате скрещивания этих штаммов былполучендиплоидD935[NSI+],демонстрирующийGuHCl-изгоняемый116супрессорный фенотип. Тетрады на среде для споруляции выявлялись лишь надесятый день, и большинство аскоспор оказались нежизнеспособными. Наосновании этих данных можно предположить, что фактор [NSI+] вызываетдефекты споруляции. Во всех двенадцати тетрадах, которые образовали четырежизнеспособныеСупрессорныйаскоспоры,фенотипнаблюдалиэлиминировалсясоотношениепри4Ade+:0Ade-.пассированиигаплоидныхсегрегантов на среде с GuHCl.
В качестве контроля использовался диплоидныйштамм D936 [nsi-], полученный в результате пассирования штамма D935 на средес GuHCl и утративший супрессорный фенотип. Во всех тетрадах, полученных врезультатеспоруляцииконтрольногодиплоидногоштаммаD936[nsi-],наблюдалось соотношение 0Ade+:4Ade-. Таким образом, фактор [NSI+], подобнодрожжевым прионам, имеет доминантное проявление и характеризуетсянеменделевским наследованием в мейозе.Инфекционность фактора [NSI+] оценивали с помощью цитодукции и методабелковой трансформации.
Цитодукцией называется процесс слияния цитоплазмыдвух клеток разного типа спаривания с последующей абортивной утратой ядраодной из клеток [Zakharov and Yarovoy, 1977]. Цитодукция происходит с высокойчастотой, если один из скрещивающихся штаммов маркирован мутацией kar1-1,препятствующей кариогамии. Для оценки инфекционности фактора [NSI+]донорный штамм 1-1-D931 [NSI+] скрещивали с реципиентным штаммом 1-D932,который помимо kar1-1 маркирован мутацией cyhR, вызывающей устойчивость кциклогексимиду,инесодержитмитохондрий.Цитодуктантыполучаютмитохондрии донорного штамма, что позволяет селектировать их на среде снеферментируемым источником углерода.
Супрессорным фенотипом, которыйэлиминируется при пассировании на среде с GuHCl, обладали 11 и 16%цитодуктантов в двух независимых выборках (таблица 11). Таким образом, [NSI+]демонстрирует цитоплазматическую инфекционность, то есть передаѐтся отдонорного штамма реципиентному при слиянии цитоплазмы.117Таблица 11. Передача фактора [NSI+] при цитодукцииДонор№Кол-во цитодуктантовЭксперимента ВсегоИз них Ade+%цитидуктантов[NSI+]([NSI+])1-1-D9311961416% ± 3.6254611% ± 4.3110800% + 0.3[NSI+]1-1-1-D931[nsi-]Примечание: После знака «±» приведена ошибка среднего.Для подтверждения инфекционных свойств [NSI+] мы трансформировалисферопласты штамма 1-D933 [nsi-] вектором pRS315 и белковым экстрактом изштамма 4-1-1-D931 [NSI+]. Вектор pRS315 использовали для повышенияэффективностиотборасферопластов,компетентныхктрансформации.Трансформантов отбирали на селективной среде и проверяли тип спаривания.
Втрѐх независимых экспериментах клоны, демонстрирующие супрессию, котораяэлиминируется на среде с GuHCl, выявлялись с частотами от 5 до 7% (таблица12). В контрольном эксперименте, где белковый экстракт был выделен из штамма[nsi-], трансформанты, демонстрирующие нонсенс-супрессию не выявлялись.Интересно отметить, что цитоплазматические прионные детерминанты,такие как [PSI+] и [URE3], передаются цитодукцией с частотой близкой к 100%,тогда как частоты передачи фактора [NSI+] значительно ниже.
Вместе с тем, припомощи метода белковой трансформации детерминант [NSI+] передаѐтся так жеэффективно, как прион [PIN+] [Patel and Liebman, 2007]. Невысокие частотыцитодукции характерны для факторов, белки-детерминанты которых имеютпреимущественно ядерную локализацию [Du et al. 2008; Patel et al., 2009]. Эти118данные позволяют предположить, что детерминант фактора [NSI+] локализован вядре.Таблица 12.
Передача фактора [NSI+] методом белковой трансформацииШтамм-донорШтаммреципиент№ экспериментаОтобранотрансформантовКоличествотрансформантов[NSI+]110052100731006110001-4-1-11-D93321000D931 [nsi-][nsi-]31000Примечание: После знака «±» указана величина ошибки среднего.4-1-1-D931[NSI+]1-D933[nsi-]Процент трансформантов[NSI+]5,0 ± 2,27,0 ± 2,66,0 ± 2,40 + 0,30 + 0,30 + 0,3На основании полученных результатов можно заключить, что фактор [NSI+]обладает всеми характеристиками дрожжевого приона – возникает de novo послеэлиминации, демонстрирует доминантное нехромосомное наследование иобладает инфекционностью.3.1.5.Генетический контроль проявления фактора [NSI+]3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияетна фенотипическое проявление [NSI+]Для выявления генов, изменение уровня экспрессии которых влияет нафенотипическое проявление [NSI+], мы оценили эффект сверхэкспрессии всехдрожжевых генов в штамме 1-1-D931 [NSI+].
Этот штамм был трансформированплазмидами библиотеки YSC4613. Библиотека включает 1588 клонов E. coli,несущих челночный многокопийный вектор pGP564 с уникальными фрагментамигенома S. cerevisiae, размером от 9 до 13 тысяч пар нуклеотидов и содержащими119от 4 до 12 открытых рамок считывания. Каждый клон содержит одну плазмиду снесколькими генами S. cerevisiae с известной индивидуальной нуклеотиднойпоследовательностью.
Штамм 1-1-D931 был трансформирован всеми плазмидамибиблиотеки, трансформантов отбирали на селективной среде без лейцина ипереносили методом отпечатков на среду без лейцина и аденина. Всего населективнойсредебезаденинабылопроанализированоповосемьтрансформантов каждой из 1588-ми плазмид. В результате скрининга былоустановлено, что на рост штамма на селективной среде без аденина влияют шестьплазмидгеномнойбиблиотеки:YGPM18l24,YGPM25e16,YGPM27n12,YGPM4g14, YGPM17m07 и YGPM18d16, причем трансформация плазмидамиYGPM4g14 и YGPM17m07 приводит к усилению роста, а YGPM18l24,YGPM25e16, YGPM27n12 и YGPM18d16 – к подавлению.Плазмиды YGPM4g14 и YGPM17m07 содержат ген ADE1, сверхэкспрессиякоторого закономерно приводит к усилению роста штамма на среде без аденина,однако не влияет на рост штамма на среде без триптофана.
Плазмида YGPM18d16содержит ген SUP35, экспрессия которого, как мы показали ранее, маскирует[NSI+]-зависимую нонсенс-супрессию. Интересно отметить, что штамм 1-1-D931содержит фактор [PIN+], и сверхэкспрессия гена SUP35 в таких штаммах обычноприводит к прионизации Sup35 и индукции нонсенс-супрессии, но в присутствиифактора [NSI+] этого не происходит.Оставшиеся три плазмиды (YGPM18l24, YGPM18l24 и YGPM25e16) наряду сдругими генами содержали ген SUP45. Этот ген кодирует основной фактортерминации трансляции eRF1 эукариот [Zhouravleva et al., 1995]. Мыпредположили, что сверхэкспрессия именно этого гена вызывает повышениеэффективности терминации трансляции в штамме 1-1-D931 и маскирует [NSI+]опосредованную нонсенс-супрессию. Для проверки этого предположения мыиспользовали центромерную плазмиду pRS315-SUP45, любезно предоставленнуюГ.А.
Журавлевой (СПбГУ), несущую ген SUP45 дикого типа под контролемсобственногопромотора.ТрансформацияплазмидойpRS315-SUP45120действительно вызвала подавление роста штамма на среде без аденина (Рис.17А).Элиминация этой плазмиды приводила к восстановлению супрессорногофенотипа.Мы предположили, что детерминант [NSI+] участвует в регуляции экспрессииSUP45 на уровне мРНК. Если на фоне [NSI+] происходит снижениеотносительного количества мРНК SUP45, то это может приводить к уменьшениюколичества данного белка и снижению эффективности терминации трансляции.Для проверки этого предположения мы сравнили относительные количествамРНК SUP45 в штаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] при помощи ПЦРРВ.Данные, полученные для четырнадцати независимо полученных проб мРНКкаждого из штаммов, воспроизведѐнные в трѐх повторностях, показали, что вштамме [NSI+] достоверно (p≤0,01) снижено количество мРНК SUP45 в сравнениисо штаммом [nsi-] (значения параметров Сt составляют 2,08±0,521 и 1,00±0,289для [NSI+] и [nsi-] штаммов, соответственно) (Рисунок 17Б).121Рисунок 17.
Фактор [NSI+] снижает уровень экспрессии гена SUP45. А –Трансформация штамма [NSI+] центромерной плазмидой с копией гена SUP45вызывает маскировку супрессорного фенотипа, но после потери плазмидыфенотип восстанавливается. Б - Относительное количество мРНК SUP45 вштаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-]. В – Сравнительный анализотносительного количества белка Sup45 в штаммах [NSI+] и [nsi-], находящихся вэкспоненциальной и стационарной фазе роста. Показаны результаты Вестерн-блотгибридизации для одной пары клонов [NSI+] и [nsi-].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
