Диссертация (1144700), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Количественные данныеденситометрического анализа вычислены для четырѐх пар независимых клонов ипредставленыкаксреднеезначениеизмеренийинтенсивностисигналовSup45/Tub1 ± стандартное отклонение.Наблюдаемая разница соответствует снижению количества мРНК SUP45 вштамме [NSI+] приблизительно в два раза (2-Ct=2,14), что полностью объясняетантисупрессорный эффект введения SUP45 на центромерной плазмиде.
Спомощью Вестерн-блот гибридизации мы сравнили количество белка Sup45 вштаммах 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на экспоненциальной и стационарнойстадии роста (дрожжи инкубировали втечение одного и трѐх дней,соответственно, в жидкой среде при 300С). Количество тотального белка в клеткахштаммов [NSI+] и [nsi-] выравнивали по методу Бредфорда [Bradford, 1976] и всоответствии с интенсивностью сигнала тубулина (Tub1) при использованииантител T6074. Результаты количественной оценки данных Вестерн-блотгибридизации показали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах[NSI+] статистически достоверно (p=0,009) снижено в сравнении со штаммами[nsi-] в клетках, находящихся в стационарной, но не в экспоненциальной фазероста. На рисунке 17В представлены результаты сравнительного анализаколичества белка Sup45 в клетках [NSI+] и [nsi-] в одной из четырех парнезависимополученныхклонов.Полученныемедианыотносительногосодержания Sup45p в штаммах [NSI+] и [nsi-] равны 0,54±0,088 и 1,00±0,260, что122соответствует снижению содержания Sup45p в штаммах [NSI+] в стационарнойфазе роста приблизительно в два раза.
Таким образом, возникновениедетерминанта [NSI+] вызывает снижение содержания мРНК SUP45 в клетке, чтозакономерно приводит к уменьшению количества белка Sup45 в стационарнойфазе роста и к нонсенс-супрессии.3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессиякоторых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-]Сверхпродукция прионформирующих белков, зачастую, хотя и не всегда,резко повышает частоту индукции прионной изоформы de novo [Wickner et al.,2002; Du and Li, 2014].
На этом свойстве базируется один из основных методовидентификации дрожжевых прионов. Для поиска белков, сверхпродукциякоторых вызывает индукцию нонсенс-супрессорного фенотипа в штамме [nsi-],была использована дрожжевая адресная библиотека YSC4613 “Open Biosystems”,плазмиды которой содержат перекрывающиеся фрагменты генома S. cerevisiae(см. главу «Материалы и методы» и предыдущий раздел).Поскольку спонтанное возникновение фактора [NSI+] было отмеченоисключительно в штаммах [PIN+], для трансформации плазмидами библиотекибыл использован штамм 1-D933 [nsi-], содержащий прионный детерминант [PIN+].В результате эксперимента было выявлено 24 плазмиды, трансформациякоторыми вызывала нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] (таблица 13). Этиплазмиды содержат 178 индивидуальных генов.
Следует отметить, чтопоследовательностигеномныхфрагментов,клонированныхвплазмидыбиблиотеки, перекрываются. С учѐтом этого, потенциальными кандидатами нароль детерминанта фактора [NSI+] могут быть только те гены, которыепредставлены в составе выявленных 24 плазмид, однако отсутствуют вплазмидах, трансформация которыми не приводит к супрессии. Таким образом,123количество потенциальных кандидатов на роль гена-детерминанта фактора [NSI+]сокращается до 75 генов.Помимосупрессиинонсенс-мутацииade1-14(UGA),фактор[NSI+]супрессирует мутацию trp1-289(UAA) и ингибирует рост дрожжей на среде сгалактозой. Мы оценили влияние выявленных в предварительном скринингепоследовательностей на весь комплекс признаков.Супрессия нонсенс–мутации trp1-289(UAA), как и ингибирование роста насреде с галактозой, была отмечена при трансформации штамма 1-D933 [nsi-] лишьодной из 24-х плазмид.
Эта плазмида содержит 11 генов, влияние которых насупрессию нонсенс-мутаций ранее показано не было. Один из этих генов, аименно VTS1 (плазмида YGPM2f04, таблица 13), контролирует стабильностьмРНК [Aviv et al., 2003] и, кроме того, кодирует потенциально прионогенныйбелок,содержащийглутамин-аспарагинобогащѐннуюпоследовательность[Harrison and Gerstein, 2003].Таблица13. Плазмиды геномной библиотеки YSC4613, трансформациякоторыми вызывает нонсенс-супрессию в штамме 1-D933 [nsi-]ПлазмидаYGPM10p05плазмидыНазвание генов в составе плазмидыCHD1, PAB1, YER165C-A, DNF1*YGPM11n12SAC3**, SSY1, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1**YGPM11p20CHD1**, PAB1, YER165C-A, DNF1*YGPM14f05LCD1**, RPL37B, PLM5, SAM2, LPP1, SPG3, PSP1, YDR506C**YGPM14k18YPR150W***, SUE1, YPR152C, YPR153W, PIN3, NCA2, TPO3, YPR157W*YGPM14l17TrpABC1***, тРНК CCA, YGL118C, YGL117W, CDC20, SNF4, YGL114W,YGPM17m07SLD3*YHR054C***, RUF5-2, YHR054W-A, CUP1-2, RSC30, YHR056W-A,CPR2**RSM23*, CWC23, SOH1, SCS3, MET13, MON1, RPS2, YGL123C-A,NAB2, GPG1, PRP43*****YAR009C*, YAR010C, тРНК AlaUGC , BUD14, ADE1, KIN3, CDC15YGPM1l02PSF1***, RAD61, YDR015C, DAD1, KCS1***YGPM15k07YGPM17i23124YGPM20f17CWC25*, SUI1, SLA2, ATG2, ZWF1**YGPM21c11Trp, YKL071W, YKL070W, YKL069W, тРНК ValтРНК CCAAAC , YKL068W-A,*NUP100мяРНК19*, POP1, ADE12, ALG9, MGS1, YNL217W, RAP1*YGPM21j14YGPM23o10lnDNF2**, YDR094W, YDR095C, GIS1, MSH6, GRX3, тРНК GUUGYGPM25l04NUP120***, YKL056C, OAR1, DEF1, MDM35, YKL053W, ASK1***YGPM28b10DDC1**, RSA1, PRM3, YPL191C, NAB3, YPL189C-A, GUP2, POS5YGPM29j24SMF2**, YHR050W-A, COX6, CIC1, RUF5-1, YHR052W-A, CUP1-1,YHR054C, RUF5-2***, YHR054W-A, CUP1-2***YOR356W***, GRD19, HAP5, VTS1, PDE2, PRT1, PRE10, PIP2,YOR364W, YOR365C***, YOR366WTrpABC1***, тРНК CCA, YGL118C, YGL117W, CDC20, SNF4, YGL114W*YGPM2f04YGPM31d16YGPM32c09YGPM4g14ALK1**, MDM39, CKB1, JAC1, ATE1, KAP122, YGL015C, PUF4,YGL014C-A, PDR1**BUD14*, ADE1, KIN3, CDC15, YAR019W-A, PAU7, YAR023C***YGPM7c22SMY1**, DHR2, YKL077W, PSY1, YKL075C, MUD2, LHS1,STB6,TrpтРНК CCASAC3**, SSY1*, YDR161W, NBP2, CWC15, SEC1, TRM82*YGPM7l21GLT1*, UGA3, UGX2, SFA1, NRP1, FAP7, CDC36*YGPM4p01Примечания.
*У гена отсутствует 3’ последовательность.5’последовательность.Нижников и др., 2011].**У гена отсутствуетУ гена могут отсутствовать некоторые регуляторные элементы [по:***Мы сконструировали плазмиду pU-VTS1, в которой последовательность,кодирующая белок Vts1, находится под контролем индуцибельного промотораCUP1. Сверхэкспрессия VTS1 в штамме 1-4-1-1-D931 [nsi-], как мы и ожидали,вызывает супрессию нонсенс-мутаций ade1-14 и trp1-289, а также вызываетингибирование роста дрожжей на среде с галактозой, но не на среде с глицерином(рис. 18А). Таким образом, эффекты сверхпродукции гена VTS1 имеют сходноепроявление с фактором [NSI+].125Рисунок 18.
Влияние изменения уровня экспрессии гена VTS1 на фенотипштаммов, содержащих фактор [NSI+]. А – Сверхэкспрессия гена VTS1 в штамме[nsi-], также как и фактор [NSI+], вызывает рост клеток на средах без аденина итриптофана и ингибирует рост на среде с галактозой, но, в отличие от [NSI+], невлияет на темпы роста на среде с глицерином; Б – Нонсенс-супрессия,возникающая в штамме [nsi-] при трансформации плазмидой pU-VTS1,элиминируется после потери плазмиды; В – Штамм 9-1-1-D931 [NSI+] с делециейгена VTS1 демонстрирует супрессию, которая элиминируется GuHCl.Вместе с тем, элиминация плазмиды pU-VTS1 приводит к потере супрессорногофенотипа (рис. 18Б). Кроме того, супрессорный фенотип сохраняется в штамме[NSI+] на фоне делеции гена VTS1 (рис.
18 В). Супрессия элиминируется на средес GuHCl. Эти данные однозначно доказывают, что ген VTS1 не являетсядетерминантом фактора [NSI+].На основании полученных результатов можно заключить, что генетическийскрининг позволил выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияетна проявление фактора [NSI+] или вызывает сходные эффекты, однако гендетерминант [NSI+] этим методом обнаружить не удалось.1263.2.Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов вдрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»Генетический скрининг не позволил выявить ген-детерминант фактора[NSI+]. Делеционный скрининг не может использоваться для выявленияжизненно-важных генов, кодирующих прионные белки, а сверхэкспрессия геновдетерминантов прионов не всегда приводит к заметному повышению частотиндукции прионов [Du and Li, 2014].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
